Jak dokładne są testy na COVID? – dr Sebastian Rushworth

Jak dokładne są testy na COVID

 

Testy na HIV – Jak bardzo jesteś dodatni [Inna strona AIDS]
COVID – dlaczego terminologia ma znaczenie? – dr Malcolm Kendrick

 

Jednym z najczęściej zadawanych pytań, jakie ostatnio otrzymuję, jest to, jak dokładne są moim zdaniem testy covid, a w szczególności testy PCR. Tak się składa, że niedawno opublikowano systematyczny przegląd w Evidence Based Medicine , w którym analizowane są testy covid (zarówno PCR, jak i przeciwciała), więc pomyślałem, że interesujące byłoby wspólne przyjrzenie się dowodom. Ten artykuł jest miejscami trochę skomplikowany technicznie i matematycznie, więc proszę o wyrozumiałość. Myślę, że ta zdobycz jest tego warta.

Najpierw zastanówmy się, jakie są te dwa typy testów i jak działają. Test PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) ma na celu wykrycie określonej sekwencji nukleotydów, a jeśli chodzi o wykrycie SARS-CoV-2, próbka jest zwykle pobierana z tylnej części gardła. Nukleotydy są budulcem genomów, a idea jest taka, że jeśli można wykryć ciąg nukleotydów specyficzny dla określonego organizmu, to dowodzi, że organizm jest obecny w miejscu pobrania próbki. Ponieważ PCR jest przeznaczony do wykrywania fragmentów genomu wirusowego, które są obecnie obecne w twoich drogach oddechowych, jego celem jest wykrycie aktualnie aktywnej infekcji (w przeciwieństwie do zakażenia w przeszłości).

 

Test PCR

 

PCR działa na zasadzie ciągłego powtarzania serii reakcji chemicznych. Jeśli poszukiwana sekwencja nukleotydów jest obecna w próbce, to za każdym razem, gdy reakcja jest powtarzana, liczba kopii sekwencji podwoi się, tak że będzie się gromadzić coraz więcej kopii.

Tak więc, jeśli zaczniesz od jednej kopii sekwencji nukleotydowej, której szukasz, to po jednym cyklu będziesz miał dwie kopie. Po dwóch cyklach będziesz mieć cztery kopie. Po trzech cyklach będziesz mieć osiem kopii. Po czterech cyklach będziesz mieć 16 kopii. I tak dalej. Jak widać, fakt, że każdy cykl podwaja liczbę kopii, oznacza, że liczby szybko rosną do ogromnych poziomów. Testy PCR na Covid  często powtarzają cykle do 40 (a czasem nawet 45) razy.

Jeśli zaczniesz od jednej kopii wirusowej sekwencji nukleotydów w próbce, to po 40 podwojeniach będziesz miał ponad 1 000 000 000 000 kopii (czyli tysiąc miliardów kopii). Powodem, dla którego wykonujesz ten powtarzający się cykl podwojenia, jest to, że gdy zdobędziesz wystarczającą liczbę kopii sekwencji, której szukasz, możesz użyć innych technologii, aby ją wykryć. Na przykład, możesz dodać do próbki cząsteczki, które w widoczny sposób zaświecą się, jeśli występuje wystarczająca liczba kopii sekwencji. Tak więc, gdy wystarczająca liczba kopii jest obecna w próbce, można je wykryć i uzyskać pozytywny wynik.

Liczba cykli, w których zdecydujesz się przejść przez kolejne etapy PCR, zanim zdecydujesz, że mimo wszystko nie ma wirusa w próbce, jest określana jako próg cyklu. Liczba cykli użytych do uzyskania pozytywnego wyniku jest w rzeczywistości bardzo ważną liczbą, ponieważ mówi, ile wirusów znajduje się w próbce. Im mniejsza liczba wymaganych cykli, tym więcej wirusa w próbce. Im większa liczba cykli, tym większe prawdopodobieństwo, że wynik jest fałszywie dodatni, prawdopodobnie spowodowany obecnością niewielkiej ilości nieaktywnego wirusa w drogach oddechowych lub zanieczyszczeniem próbki w laboratorium. Jak powiedziałem, po 40 cyklach nawet pojedyncza kopia sekwencji wirusa ma ponad tysiąc miliardów kopii.

Jedną z rzeczy, które należy w tym momencie zrozumieć jest to, że PCR wykrywa tylko sekwencje genomu wirusa, nie jest w stanie wykryć całych cząsteczek wirusa, więc nie jest w stanie powiedzieć, czy to, co znajdujemy jest żywym wirusem, czy tylko niezakaźnymi fragmentami genomu wirusa. Jeśli otrzymujesz pozytywny wynik testu PCR i chcesz mieć pewność, że to co znajdujesz jest prawdziwie pozytywne, musisz wykonać hodowlę wirusową. Oznacza to, że pobierasz próbkę, dodajesz ją do komórek oddechowych na płytce Petriego i sprawdzasz, czy możesz skłonić te komórki do rozpoczęcia produkcji nowych cząsteczek wirusa. Jeśli tak, to wiesz, że masz naprawdę pozytywny wynik. Z tego powodu hodowla wirusów jest uważana za „złoty standard” w diagnostyce infekcji wirusowych. Jednak ta metoda jest rzadko stosowana w praktyce klinicznej, co oznacza, że w rzeczywistości diagnoza jest często oparta całkowicie na teście PCR. W tym systematycznym przeglądzie zdolności do hodowli żywego wirusa po pozytywnym teście PCR stwierdzono, że prawdopodobieństwo uzyskania fałszywie pozytywnego wyniku znacznie wzrasta z każdym kolejnym cyklem po 24 cyklu. Po 35 cyklu żadne z badań zawartych w tym przeglądzie nie było w stanie wyhodować żywego wirusa.

W większości przypadków klinicznych (w tym również w tym, w którym pracuję), lekarz otrzymuje tylko pozytywny lub negatywny wynik. Nie wspomina się o liczbie cykli użytych do uzyskania pozytywnego wyniku. Jest to problem, ponieważ jasne jest, że wynik pozytywny po 40 cyklach jest prawie na pewno fałszywie pozytywny, podczas gdy wynik pozytywny po 20 cyklach jest najprawdopodobniej prawdziwie pozytywny. Bez informacji o liczbie cykli należy założyć, że pacjent siedzący przed nami ma covid i jest zakaźny, ze wszystkimi konsekwencjami, które z tego wynikają.

PCR-yzm czyli współczesny łysenkizm – prof. dr hab. Roman Zieliński
Testy PCR na COVID-19 z naukowego punktu widzenia są pozbawione sensu – Torsten Engelbrecht i Konstantin Demeter
Co miał wykrywać test na koronawirusa? – Celia Farber

W każdym razie, na razie wystarczy wiedzy o tym teście na bazie PCR.

Test na przeciwciała

 

Innym głównym rodzajem testu jest test na przeciwciała. Jak dokładne są testy na COVID?  Tutaj próbka jest zwykle pobierana z krwiobiegu. Istnieje pięć różnych typów przeciwciał, ale większość testów na przeciwciała szuka tylko jednego typu, IgG, który jest najbardziej powszechnym typem. Ogólnie rzecz biorąc, po tygodniu lub dwóch od zakażenia trwającego tydzień lub dwa, zanim dana osoba zacznie produkować IgG, a w przypadku covid, zazwyczaj infekcja trwa tylko około tygodnia od wystąpienia objawów, więc testy na obecność przeciwciał nie są przeznaczone do wykrywania aktywnych zakażeń. Zamiast tego celem jest sprawdzenie, czy w przeszłości miałeś infekcję.

Jedną z powszechnych metod stosowanych w testach przeciwciał jest ELISA (test immunoenzymatyczny). W tej metodzie masz płytkę, na której utrwaliłeś antygen, z którym może wiązać się poszukiwane przeciwciało (przeciwciała wiążą się z antygenami – antygen to skrót od „generator przeciwciał” i jest to zasadniczo struktura molekularna, do tworzenia powiązań z którą określone przeciwciało jest specjalnie zaprojektowane).

Następnie dodajesz do płytki próbkę krwi, którą chcesz zbadać, i w tym momencie przeciwciała w próbce wiążą się z antygenami (zakładając, że przeciwciała, które chcesz znaleźć, są rzeczywiście obecne w próbce). Następnie należy umyć płytkę, tak aby wszystkie inne przeciwciała w próbce, których aktywnie nie szukasz, zostały wypłukane (ponieważ nie ma antygenu, z którym mogłyby się wiązać).

Następnie dodaje się molekułę sygnalizacyjną, która może wiązać się z przeciwciałami i która ma zdolność do zmiany koloru pod wpływem pewnego enzymu. Następnie należy ponownie umyć płytkę. Jeśli nie ma przeciwciał przyklejonych do płytki, aby cząsteczka ta związała się z płytką, zostanie ona wypłukana. Jeśli poszukiwane przeciwciała były obecne w próbce krwi, to przykleiły się do antygenu na płytce, a ta nowa molekuła z kolei przykleiła się do nich.

Na koniec dodajesz enzym, który zmienia kolor cząsteczki sygnalizacyjnej. Jeśli molekuła sygnalizacyjna nie została wypłukana w poprzednim kroku, to zobaczysz, że płytka zmieniła kolor, a test na obecność przeciwciał jest pozytywny.

Oprócz zrozumienia, jak działają testy, musimy również zrozumieć dwa ważne terminy, zanim przejdziemy do szczegółów ostatniego przeglądu systematycznego. Terminy te to czułość i swoistość i są krytyczne dla wszystkich testów diagnostycznych stosowanych w medycynie, ponieważ mówią one o tym, jak dobry jest test.

Czułość testów diagnostycznych

 

Czułość to prawdopodobieństwo, że choroba zostanie wykryta, jeśli dana osoba faktycznie ją ma. Na przykład test na raka piersi o czułości 90% wykryje raka piersi w 90% przypadków. Dziewięć na dziesięć pacjentek z rakiem piersi zostanie prawidłowo poinformowanych, że cierpią na tę chorobę. Jedna na dziesięć pacjentek zostanie błędnie poinformowana, że nie ma choroby, mimo że ją ma.

Swoistość testów diagnostycznych

 

Swoistość/specyficzność jest przeciwieństwem czułości. Jest to prawdopodobieństwo, że osoba, która nie ma choroby, zostanie poinformowana, że jej nie ma. Tak więc specyficzność 90% dla naszego wyimaginowanego testu na raka piersi oznacza, że dziewięć na dziesięć osób, które nie mają raka piersi, zostanie prawidłowo poinformowanych, że go nie mają. Jedna na dziesięć osób, które nie mają raka piersi, zostanie niesłusznie poinformowana, że go ma.

Innymi słowy, czułość to zdolność testu do wykrywania prawdziwych wyników pozytywnych. Swoistością jest zdolność testu do unikania fałszywych wyników pozytywnych. Idealny test będzie miał 100% czułość i swoistość, co oznacza, że złapie każdego, kto ma chorobę, i nie powie nikomu, że ją ma, jeśli tego nie zrobi. Taki test nie istnieje. Ogólnie rzecz biorąc, czułość i swoistość są ze sobą sprzeczne – jeśli podniesiesz jedno, drugie opadnie.

Gdybym po prostu powiedział wszystkim, których spotykam, że mają raka piersi, moja czułość na wykrycie raka piersi wynosiłaby 100%, ponieważ nie przegapiłbym żadnego przypadku, ale moja swoistość wynosiłaby 0%, ponieważ każda pojedyncza osoba, która nie ma raka piersi, zostałaby poinformowana, że go ma. Tak więc, projektując test, musisz zdecydować, czy chcesz zmaksymalizować czułość czy swoistość. Jeśli projektujesz test PCR na covid z progiem 40 cykli, wtedy dążysz do osiągnięcia maksymalnej czułości – prawdopodobieństwo pominięcia przypadku jest zminimalizowane, ale uzyskasz o wiele więcej fałszywych wyników pozytywnych niż w przypadku ustawienia progu na 30.

Wyniki fałszywie pozytywne na COVID-19 – dr Andrew Kaufman
Dr Mike Yeadon: Jaki jest wskaźnik fałszywie dodatnich wyników? [17 wrzesień]

Ok, teraz, gdy wiemy, co to jest test PCR i czym jest test na przeciwciała oraz rozumiemy czułość i swoistość, możemy przejść do ostatniego przeglądu systematycznego. Przegląd obejmował 38 badań nad testami PCR (oraz nad testami LAMP, alternatywną techniką, która jest podobna do PCR). Ogólna czułość dla testów PCR/LAMP wynosiła od 75% do 100% w różnych badaniach, podczas gdy ogólna swoistość wynosiła od 88% do 100%. W 16 badaniach, w których łącznie wzięło udział 3 818 pacjentów, udało się zebrać razem, aby uzyskać dokładniejsze oszacowanie czułości. W połączonej analizie wrażliwość określono na 88%. Nie było możliwe określenie zbiorczej wartości swoistości, ponieważ badaniami włączonymi do zbiorczej analizy były wszystkie osoby, o których wiadomo było już z całkowitą pewnością, że są zakażone COVID.

Jak dokładne są testy na COVID?

 

Przegląd obejmował 25 badań testów przeciwciał, ale tylko 10 z nich (łącznie 757 pacjentów) dostarczyło wystarczających danych do obliczenia czułości. Czułość testów na przeciwciała wahała się od 18% do 96%. 12 badań dostarczyło wystarczających informacji do określenia swoistości, przy czym wahała się ona od 89% do 96%.

https://ebm.bmj.com/content/early/2020/09/30/bmjebm-2020-111511

Ok, może być trudno zrozumieć, co te liczby oznaczają w praktyce, więc pobawimy się z nimi trochę, aby to wyjaśnić, i skupię się na teście PCR w tej końcowej dyskusji, ponieważ to właśnie on wywołuje histerię wokół COVID. Jak dokładne są testy na COVID? Jak wspomniano, czułość testu PCR wydaje się wynosić około 88%. Dobra wartość swoistości jest trudniejsza do określenia, ale jest między 88% a 100%, więc jeśli przyjmiemy specyficzność 94% (w połowie między tymi dwiema wartościami), prawdopodobnie nie jesteśmy daleko.

Powiedzmy, że choroba rozprzestrzenia się gwałtownie w całej populacji, a jedna na dziesięć osób jest zarażona w tym samym czasie. Jeśli przebadamy losowo 1000 osób, będzie to oznaczać, że 100 z nich rzeczywiście ma covid, a 900 nie. Z tych 100, którzy mają covid, test z powodzeniem obejmie 88. Z 900 osób, które nie mają covida, test poprawnie powie 846, że ich nie mają, ale powie również 54 zdrowym ludziom, że mają covid.  W sumie 142 osoby na 1000 dowiadują się, że mają covid. Z tych 142 osób 62% faktycznie choruje, a 38% nie.

To nie jest świetne. Cztery na dziesięć osób, które uzyskały pozytywny wynik testu, w rzeczywistości nie mają zakażenia COVID, nawet w sytuacji, gdy choroba występuje tak często, że 10% osób poddawanych testom rzeczywiście choruje.

Niestety jest coraz gorzej

 

Niestety jest coraz gorzej. Załóżmy, że choroba zaczyna słabnąć, a obecnie tylko jedna na sto badanych osób ma covid. Jeśli przetestujemy 1000 osób, będzie to oznaczało, że dziesięciu będzie miało rzeczywiście covid, a 990 nie. Z dziesięciu, którzy mają covid, dziewięciu zostanie poprawnie poinformowanych, że ma chorobę. Spośród 990, które go nie mają, 931 zostanie prawidłowo poinformowanych, że go nie ma, a 59 zostanie błędnie poinformowanych, że chorują. W sumie 68 osób zostanie poinformowanych, że mają covid. Ale tylko 9 z 68 faktycznie będzie miało tę chorobę. Innymi słowy, w sytuacji, gdy tylko 1% badanej populacji ma tę chorobę, 87% wyników pozytywnych będzie fałszywie pozytywnych.

Jest jeszcze jedna rzecz, na którą moim zdaniem warto zwrócić uwagę. Kiedy jedna na dziesięć badanych osób ma chorobę, uzyskuje się 142 pozytywne wyniki na 1000 badanych osób. Ale kiedy jedna osoba na sto zachoruje, uzyskuje się 68 pozytywnych wyników. Tak więc, chociaż faktyczna częstość występowania choroby zmniejszyła się dziesięciokrotnie, częstość występowania pozytywnych wyników PCR spadła tylko o połowę. Więc jeśli patrzysz tylko na wyniki PCR i uważasz, że jest to dokładne odzwierciedlenie tego, jak powszechna jest choroba w populacji, to zostaniesz oszukany, ponieważ choroba wydaje się być znacznie bardziej rozpowszechniona niż jest.

Wiara w szybki test [na krztuśca] doprowadziła do epidemii, której nie było

Zróbmy ostatni eksperyment myślowy, aby to zilustrować. Powiedzmy, że choroba jest teraz bardzo rzadka, i tylko jedna na tysiąc przebadanych osób faktycznie ma COVID. Jeśli przetestujesz 1000 osób, otrzymasz 61 pozytywnych wyników. Jeden z nich będzie prawdziwie pozytywny, a 60 będzie fałszywie pozytywnym. Tak więc, chociaż częstość występowania prawdziwej choroby ponownie spadła dziesięciokrotnie, liczba wyników pozytywnych zmniejszyła się tylko nieznacznie, z 68 do 61 (z czego 60 to fałszywie pozytywne!). Tak więc, patrząc tylko na pozytywne wyniki testów PCR, można łatwo przekonać się, że choroba jest nadal mniej więcej tak samo rozpowszechniona w populacji, nawet jeśli przechodzi od obecności u jednej na sto osób do obecności tylko u jednej na tysiąc. Im rzadsza choroba staje się w rzeczywistości, tym mniej prawdopodobne jest, że zauważysz różnicę w liczbie testów dających pozytywne wyniki.

Chcę to powtórzyć, w nieco inny sposób, aby upewnić się, że wiadomość dotrze do Ciebie. Chociaż choroba spada ogromnie, stukrotnie, z jednego na dziesięć do jednego na tysiąc badanych osób, liczba pozytywnych wyników PCR zmniejszyła się o połowę, ze 142 do 61. Tak więc ogromna redukcja prawdziwych infekcji powoduje jedynie niewielką redukcję „przypadków” potwierdzonych przez PCR. W rzeczywistości choroba mogłaby zniknąć z powierzchni Ziemi i nadal otrzymywałbyś 60 pozytywnych wyników na każde 1000 przeprowadzonych testów!

Ta sama tendencja jest widoczna, nawet jeśli test PCR miałby mieć znacznie lepszą swoistość niż szacujemy tutaj, powiedzmy 99%. Oto krótka ilustracja, ponieważ nie chcę Cię męczyć zbyt wieloma liczbami. Jeśli co dziesiąty ma chorobę i przebadasz 1000 osób, otrzymasz 97 pozytywnych wyników, z których 88 będzie prawdziwie pozytywnych, a 9 będzie fałszywie pozytywnych. Jeśli jeden na 100 ma chorobę, otrzymasz 19 wyników pozytywnych, z których 9 będzie prawdziwie pozytywnych, a 10 będzie fałszywie pozytywnych. Jeśli jedna osoba na 1000 ma tę chorobę, otrzymasz 12 wyników pozytywnych, z których 11 będzie fałszywie pozytywnych.

Tak więc, nawet jeśli test ma bardzo wysoką swoistość 99%, gdy wirus przestaje być obecny na poziomie pandemii w populacji i zaczyna spadać do bardziej endemicznych poziomów, szybko dochodzisz do punktu, w którym większość pozytywnych wyników jest fałszywie pozytywna, a choroba wydaje się być znacznie bardziej rozpowszechniona niż w rzeczywistości.

Jak widać, im rzadziej choroba występuje w rzeczywistości, tym bardziej prawdopodobne jest, że test wygeneruje fałszywie pozytywny wynik, i tym mniej przydatny jest jako metoda na ustalenie, kto właściwie ma covid. A im mniej powszechna jest choroba, tym bardziej powszechna będzie się wydawać w stosunku do rzeczywistości. Jeśli decyzje dotyczące covid nadal będą podejmowane w dużej mierze w oparciu o to, co pokazują testy PCR, być może nigdy nie będziemy w stanie odwołać pandemii!

I to właśnie dlatego, panie i panowie, przypadki z pozytywnym wynikiem PCR są bardzo słabym wskaźnikiem rozpowszechnienia covid w populacji, a zamiast tego powinniśmy opierać decyzje na wskaźnikach hospitalizacji, przyjęć na OIOM i zgonów. Jeśli przyjrzymy się tylko testom PCR, to nadal będziemy wierzyć, że choroba ta jest szeroko rozpowszechniona w populacji w nieskończoność, nawet jeśli w rzeczywistości staje się coraz mniej powszechna. I to przy założeniu, że wskaźnik testów nie wzrasta. Jeśli połączymy ten wbudowany problem z dokładnością, z masowym wzrostem liczby testów (jak to miało miejsce w większości krajów w czasie trwania pandemii), wówczas będziemy mogli stworzyć wrażenie, że choroba nadal rozprzestrzenia się dziko w populacji, nawet jeśli tak nie jest.

Źródło: How accurate are the covid tests?
Tłumaczenie: AlterShot.TV

Kalkulator fałszywie pozytywnych wyników dla Testów PCR

 

Jak [NIE] Działają Testy PCR na COVID-19 -Del Bigtree

 

Profesor Kornelia Polok i profesor Roman Zieliński o testach PCR i problemach z ich używaniem w diagnostyce koronawirusa

 

Za pomocą tego testu nie jesteśmy w stanie odróżnić, czy koronawirus dokonał jedynie kolonizacji błon śluzowych czy już zakażenia poprzez wniknięcie do komórek, w których uzyskał zdolność do namnażania się. Nie jesteśmy nawet w stanie powiedzieć, czy uzyskany pozytywny wynik związany jest z obecnością wirusa w naszym organizmie czy też są to jedynie nieaktywne jego cząstki.

Powielony w wyniku reakcji RT-qPCR materiał genetyczny w ogóle nie musi należeć do koronawirusa. Pamiętajmy, że materiał biologiczny pobrany w wymazie z nosogardzieli jest zanieczyszczony innym materiałem genetycznym, innymi wirusami, bakteriami, ludzkim DNA. Użyte w tej reakcji startery mogą również namnożyć ten materiał genetyczny. Dzieje się tak dlatego, ponieważ sekwencje homologiczne do użytych w reakcji starterów znajdują się w tym `zanieczyszczonym` materiale genetycznym. Reasumując, wynik pozytywny świadczy jedynie o tym, że jakiś materiał genetyczny został namnożony w wyniku reakcji RT-PCR. Aby określić, jakie jest jego pochodzenie, należałoby zsekwencjonować produkt tej reakcji. Przytoczone wcześniej wyniki zaprezentowane przez panel CDC1 pokazują, że uzyskany wynik pozytywny w teście na obecność koronawirusa to w 65% wynik fałszywie pozytywny. Ten wynik świadczy o obecności w wymazie innego materiału genetycznego niż koronawirusa

Testy wykorzystujące reakcję PCR są wrażliwe na każde zanieczyszczenie, na każde odstępstwo od procedury. Poza tym trzeba również wiedzieć, jak odczytywać te wyniki. Jest to szczególnie istotne w przypadku odmiany ilościowej PCR (qPCR – Real Time PCR), która jest stosowana w diagnostyce koronawirusa, ponieważ nie mamy tutaj wizualnej kontroli wyników na trwałym nośniku, jakim jest na przykład żel agarozowy lub poliakrylamidowy. Przede wszystkim istotne jest rozróżnienie pomiędzy wynikiem, który nam pokazuje, że reagują ze sobą same startery albo same odczynniki, tworząc tzw. dimery, a faktycznym produktem reakcji. Dla osób, które nie mają wprawy, nie jest to proste, tym bardziej że w przypadku testu na koronawirusa przewidywany produkt reakcji jest stosunkowo krótki (około 100 par zasad) i może być mylony z dimerami, które powstają w wyniku reakcji starterów ze sobą.

Najistotniejszym czynnikiem wpływającym na negatywne wyniki są startery, które są elementem, który w głównej mierze odpowiada za specyfikę reakcji. Dobrze zaprojektowany starter powinien mieć określoną długość (najczęściej około 20 par zasad), stabilność, która związana jest z przewagą zasad GC (powyżej 50%) oraz stabilnością końca 3’.

Startery nie powinny reagować ze sobą, tworząc tzw. homodimery (łączą się wówczas dwa identyczne startery) lub heterodimery (łączą się różne startery). Analiza starterów wykorzystywanych w teście PCR na koronawirusa nie jest łatwa, ponieważ producenci kitów niechętnie udostępniają takie informacje, zasłaniając się prawami patentowymi lub odwołując do list starterów rekomendowanych przez CDC i WHO.

Panel CDC 2019-n-CoV-2 wymienia na cele diagnostyczne tylko akceptowane zestawy, ale nie podaje sekwencji starterów. Sekwencje te są podane w części opisanej jako startery do badań. Dodatkowo w przestrzeni publicznej można znaleźć startery podane przez Instytut Pasteura i startery używane przez Chiński Instytut Kontroli oraz Zapobiegania Chorobom Wirusowym (CDC Chiny).

Mówiąc o trudnościach w dostępnie do informacji o starterach, można dojść do wniosku, że nie mam prawa wiedzieć, jaki test/lek mi się aplikuje. Zastanawiam się, czy nie jest to przejaw komercjalizacji nauki posuniętej do granic rozsądku, o czym mówiliśmy w wywiadzie dla AlterShotTV. Przez wiele lat podstawą pracy badawczej było samodzielne projektowanie starterów oraz optymalizacja reakcji PCR. Teraz proponuje mi się kit, o którym niewiele wiem, łącznie z brakiem informacji o starterach. Optymalizacja takiego kitu jest praktycznie niemożliwa. W efekcie o wynikach testu decyduje firma, która może go lepiej lub gorzej skomponować.

Oczywiście mogę samodzielnie skorzystać z sekwencji koronawirusa zdeponowanych w bazie NCBI i zaprojektować startery np. dla genu N. Obawiam się jednak, że szybko okazałoby się, że ktoś ma patent na ten gen i nie mogę bezkarnie projektować starterów, nawet gdybym wyizolował koronawirusa np. ze swojego wymazu i samodzielnie go zsekwencjonował.

Doszliśmy do sytuacji, w której coś, co jest elementem mojego organizmu, nie zawsze jest moją własnością. Może trochę przejaskrawiam, ale liczne procesy sądowe dotyczące patentowania ludzkich genów potwierdzają te obawy. Przykładowo genów człowieka nie można patentować, bo jest to produkt naturalny. Natomiast cDNA otrzymany na bazie danego genu już można.

To oddzielenie procesu badawczego od komercyjnych zastosowań prowadzi do powszechnego przekonania, że materiał genetyczny do PCR nie musi być czysty, że w odwrotnej transkrypcji nie powstaje hybryda, tylko od razu gotowa cząsteczka cDNA, że PCR jest łatwy do wykonania, gdyż wystarczy zmieszać zawartość np. dwóch probówek. Te nieszczęsne testy PCR na koronawirusa pokazały, że posunięty do granic możliwości scjentyzm w połączeniu z zastosowaniami komercyjnymi utracił z pola widzenia człowieka.

Pomimo nadmienionych trudności postanowiliśmy przeanalizować wszystkie dostępne startery pod kątem prawidłowości ich zaprojektowania. Wnioski są niestety zatrważające. Tylko jedna para starterów specyficzna dla genu ludzkiej RNazy P (panel CDC 2019-nCoV-2) pozwala na przeprowadzenie specyficznej reakcji z  minimalizacją wyników fałszywie negatywnych, co pokazane jest w  tabeli 2, gdzie startery zaznaczone są na zielono. Jest to jedyna para, w której oba startery mają więcej niż 50% par GC, co zwiększa ich stabilność. Startery te mają zbliżoną i wysoką temperaturę topnienia, co pozwala na zastosowanie stosunkowo wysokiej temperatury przyłączania starterów. Jest ona nieznacznie wyższa (1oC) od temperatury topnienia starterów, co stwarza szansę na rozbicie dimerów oraz przyłączenie się starterów do matrycy. Dimery, czyli efekty reakcji starterów samych ze sobą, znacznie obniżają efektywność reakcji PCR. Startery nie przyłączają się do matrycy, tym samym generując wyniki fałszywie negatywne. Jeżeli produkty reakcji są krótkie, to dimery mogą być mylone z właściwym produktem, dając wyniki fałszywie pozytywne.

Niestety, stabilne dimery, zaznaczone na żółto w tabeli 2, powstają dla wszystkich par starterów. Szczególnie problematyczne są oba startery 2019-nCoV-N2, które tworzą silne struktury drugorzędowe (w  tabeli 2 zaznaczone na czerwono). W zasadzie powinny one zostać przeprojektowane, gdyż stwarzają duże prawdopodobieństwo wyników fałszywie negatywnych. Uzyskane przez nas wyniki nie są odosobnione. Chociażby Park i pozostali autorzy tej publikacji (2020) zwracali uwagę na problemy ze starterami w testach PCR na koronawirusa.

Kolejnym aspektem związanym ze starterami jest temperatura ich przyłączania się do matrycy. Jest to najważniejszy parametr wpływający na specyfikę reakcji. Temperaturę tę wyznacza się na podstawie tzw. temperatury topnienia starterów, czyli temperatury, w której 50% startera jest połączonego z matrycą. Za optymalną temperaturę przyłączania przyjmuje się właśnie temperaturę topnienia startera. Jeżeli mamy jeden starter, to sprawa jest prosta, ale w przypadku dwóch starterów idealnie byłoby je dobrać tak, aby miały taką samą lub bardzo zbliżoną temperaturę topnienia. Warunek ten spełnia większość par starterów. Niestety istnieje bardzo duża rozbieżność pomiędzy optymalną temperaturą przyłączania starterów a tą rekomendowaną przez panel CDC dla reakcji qPCR. Stosowana temperatura jest nawet o  7-10oC wyższa od optymalnej wyznaczonej na podstawie starterów.

Ta reakcja nie ma szans zajść prawidłowo. Jeżeli temperaturę przyłączania starterów w  reakcji PCR podniesiemy znacznie (np. powyżej 5oC), to startery nie połączą się z matrycą i będą występowały w mieszaninie reakcyjnej jako jednoniciowe fragmenty (zdenaturowane). Zbyt wysoka temperatura uniemożliwia nawet tworzenie dimerów. Z naszej praktyki wynika, że czasami wystarczy podnieść temperaturę przyłączania starterów o 1-2oC powyżej temperatury topnienia, aby reakcja nie wyszła. Czyli wiele wyników negatywnych może wynikać nie tyle z braku matrycy, ile z braku jakiegokolwiek produktu reakcji. Po prostu reakcja nie zaszła.

Przeprowadzający reakcję diagnosta taki rezultat analizy na obecność koronawirusa zakwalifikuje jako wynik negatywny. Wyjściem nie jest obniżenie temperatury, gdyż wówczas startery przyłączają się losowo i mamy wyniki fałszywie pozytywne. Niestety, niezbyt starannie zaprojektowane startery mszczą się później w trudnościach z uzyskaniem wiarygodnych wyników reakcji PCR.

Prof. Kornelia Polok i Prof. Roman Zieliński

kompilacja własna na podstawie naszego wywiadu „PCR-yzm – O prawdziwej roli testów” oraz fragmentów z wywiadu dla dr. Mariusza Błochowiaka – całość znalazła się w książce „Fałszywa pandemia. Krytyka naukowców i lekarzy PCR cz.2”

Książka dostępna jest już jest w przedsprzedaży, oficjalna promocja odbędzie się w Rzeszowie 16 listopada o godz. 18.

#Testdemia #PCRGate

Źródło: AlterShot.TV

Charakterystyka starterów wykorzystywanych w testach RT-qPCR wykrywających koronawirusa.

Charakterystyka starterów wykorzystywanych w testach RT-qPCR wykrywających koronawirusa.

%d bloggers like this: