Efekt cytopatyczny (CPE) – eksperyment kontrolny – dr Stefan Lanka
– Przejdźmy to tematu głównego. CPE, skrót oznaczający w języku angielskim efekt cytopatyczny. Eksperyment kontrolny.
Dr Stefan Lanka: Zgadza się.
– Zamierzasz zaprezentować nam efekty swojej pracy.
Dr Stefan Lanka: Owszem. Mam już pierwsze wyniki mojego eksperymentu. Mam je przed sobą i pokazują one jasno, jasno wskazują, że efekt, który jest traktowany przez wirusologów jako dowód, że tkanka czy materiał komórkowy przekształca się w [wypluwa z siebie] wirusa, że identyczne rezultaty możemy otrzymać stosując metody obróbki komórek bez konieczności wprowadzenia rzekomo zainfekowanych komórek do próbki. Mam tutaj planszę ze zdjęciami, które możemy pokazać. Mam kontrolę nad obrazem, czy Ty pokażesz planszę?
– Sądzę, że powinieneś móc je już pokazać, udostępniłem Ci kontrolę nad obrazem. Proszę.
Dr Stefan Lanka: Tak, to są właśnie te plansze. Tutaj mamy świeżo wyizolowane tkanki, odseparowane, w tej postaci dalej określane jako komórki. Tutaj mamy komórki te umieszczone w medium stosowanym przez wirusologów. Do ośrodka dodaliśmy serum płodowe z cieląt (FCS), stanowiący 10 proc. objętości. Dodaliśmy także małą dawkę antybiotyków tak, aby przyzwyczaić komórki do ich obecności. Tutaj mamy obraz pokazujący początkową fazę eksperymentu.
Podobnie jak wirusolodzy, zmniejszamy ilość roztworu ze składnikami odżywczymi drastycznie ze standardowej wartości 10 proc. do wartości 1 proc., a następnie dodajemy dużą dawkę, 3-krotnie wyższą, antybiotyków. Łatwo zauważyć, że ta zmiana nie jest korzystna dla komórek, co widać już po jednej dobie od wprowadzenia tej zmiany.
Po 5 dniach obserwujemy rozległy rozkład komórek na tej samej zasadzie jak proces, który wirusolodzy interpretują jako proces prowadzący do obumierania komórki, wzrostu toksyczności, czyli efekt cytopatyczny, w skrócie CPE.
Efekt ten możemy wyraźniej nawet zaobserwować po dodaniu kolejnego źródła RNA. Tutaj mamy RNA pochodzące od drożdży. Wprawdzie nie jest to materiał od standardowych drożdży, ale substancja pośrednicząca, fragmenty RNA pobrane z drożdży w celu sprawdzenia, jak komórka poradzi sobie z obecnością takiego materiału. Do tak przygotowanej próbki dodajemy zainfekowane cząsteczki w postaci kwasów nukleinowych.
Obumieranie i śmierć komórki ma nawet bardziej dramatyczny przebieg. Przedwczoraj otrzymałem wyniki badań RNA wyizolowanego z takiej próbki, z probówek kontrolnych oraz probówek eksperymentalnych z wirionami.
Wyizolowaliśmy RNA, które teraz jest sekwencjonowane. Jakość pozyskanego RNA jest znakomita w kontekście naszych zastosowań. Wczoraj otrzymałem te wyniki. Zatem wirusologia została obalona już na pierwszym etapie, ponieważ jasno pokazaliśmy, że główny efekt, czyli śmierć komórki w próbce testowej, taki efekt jesteśmy w stanie wygenerować bez obecności zainfekowanego materiału biologicznego. Wirusolodzy już dawno powinni taki kontrolowany eksperyment przeprowadzić po roku 1954.
Do dnia dzisiejszego nie mamy jakichkolwiek udokumentowanych informacji o przeprowadzeniu takiego eksperymentu. Otrzymany przez nas wynik jest identyczny z tym efektem, efektem cytopatycznym, CPE, który stanowi dla wirusologów dowód obecności wirusa w komórkach, a te obumierające komórki, nazywane izolatem, następnie są oferowane na rynku za kwotę około 2 tys. euro. Twierdzą oni, że oto jest nasz wirus i na jego bazie jesteśmy w stanie stworzyć szczepionkę.
Jeśli szczepionka zawiera całe patogeny, to jest to tzw. szczepionka żywa, a jeśli zawiera fragmenty patogenu, pojedyncze białka, to mamy wtedy do czynienia ze szczepionką inaktywowaną, a ponieważ zawiera on tylko fragment patogenu, więc nie jest on zjadliwy.
Ta szczepionka jest zarejestrowana jako szczepionka nieaktywowana. To właśnie udało nam się osiągnąć. To jest element dowodu wykazującego błędne założenia wirusologii. Tutaj widzimy obraz tkanki pod mikroskopem elektronowym i gwarantuję, że te same cząsteczki zostaną zaobserwowane w przypadku niezainfekowanej tkanki, a które jak twierdzą wirusolodzy są cząsteczkami wirusa. Ten obrazek pokazuje stan obecny.
Kluczowy element w wirusologii, czyli kwas nukleinowy. Obecnie sekwencjonujemy zebrany materiał, zupełnie podobnie jak wirusolodzy, korzystamy z tych samych programów komputerowych, które są dostępne na naszych komputerach, rekonstruujemy taki sam genom jak w przypadku SARS-CoV-2, HIV, czy wirus odry czy eboli z tego właśnie materiału, a który nigdy nie był zainfekowany, nie miał kontaktu z materiałem pobranym od pacjenta.
Pierwszy etap naszego eksperymentu z grupą kontrolną zakończył się sukcesem. Teraz czekamy na obrazy z mikroskopu elektronowego, a później na wyniki badań genetycznych. Już na tym etapie został obalony centralny argument wirusologii. Ten efekt obserwowany w komórkach, efekt cytopatyczny, będący dowodem, że komórki te obumierają z powodu wirusa, my zdecydowanie wykazaliśmy fałszywość tego założenia. To jest nasz pierwszy sukces, te dane są tutaj po raz pierwszy prezentowe publicznie.
– To jest mała niespodzianka, czy właściwie olbrzymia sensacja, ale Ty wiedziałeś już wcześniej że tak to się skończy.
Dr Stefan Lanka: Zgadza się, tego się spodziewałem, jako biolog, że tak to będzie wyglądać. Mieliśmy już z tym do czynienia w przypadku odry. W przypadku wirusa odry przeprowadziłem dokładnie taki sam eksperyment. Wtedy jednak nie zsekwencjonowaliśmy RNA, by obalić istnienie wirusa, ale też nie było ku temu potrzeby.
Efekt cytopatyczny (CPE) – Eksperyment kontrolny – dr Stefan Lanka [napisy PL]
Zobacz na: Społeczne procesy poznawcze – Józef Kossecki
Wywiad z dr Stefanem Lanka o błędach metodologicznych w izolowaniu wirusów
Ponad 30 000 opublikowanych badań może być błędne z powodu zanieczyszczonych komórek – Peter Dockrill
Wirusy w szczepionkach – żywe, atenuowane i inaktywowane
Technologie wytwarzania szczepionek
Ciekawostki o Antybiotykach i Substancjach Odżywczych stosowanych w doświadczeniach
Szczegóły:
-Antybiotyki są stosowane w hodowlach komórkowych, aby zapobiec obecności bakterii, ponieważ bakterie mogą zabijać zdrowe komórki laboratoryjne. Jednakże, negatywny eksperyment kontrolny pokazuje, że antybiotyki, a nie rzekomy wirus, zabijają zdrowe komórki laboratoryjne.
-Pozbawienie substancji odżywczych jest stosowane, aby ułatwić zdrowym komórkom laboratoryjnym wchłanianie rzekomego wirusa. Praktyka ta sprawia, że w rzeczywistości komórki umierają z powodu głodu. Świadczy o tym negatywny eksperyment kontrolny.
Antybiotyki w hodowlach komórkowych
Jaki jest mechanizm toksyczności antybiotyków? Antybiotyki zabijają komórki poprzez uszkodzenie potencjału błonowego mitochondriów, uszkodzenia DNA, zwiększoną ekspresję genów odpowiedzialnych za enzymy glikolityczne.
„Wiele komórek hoduje się w podłożach zawierających antybiotyki, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu. Skażenie mykoplazmą i innymi bakteriami jest poważnym problemem dla osób zajmujących się hodowlą komórek. Antybiotyki w pożywkach pomagają zapobiegać tym zanieczyszczeniom i ułatwiają życie badaczom, ponieważ przeprowadzanie eksperymentów z hodowlami komórkowymi w pożywkach bez antybiotyków jest trudne i wymaga energicznej, sterylnej techniki. Istnieje wiele doniesień o tym, że antybiotyki powodują uszkodzenia mitochondriów. W niniejszej pracy badaliśmy wpływ gentamycyny w podłożach hodowlanych ludzkiego nabłonka sutka MCF-12A oraz linii komórkowej raka piersi MCF-7 i MDA-MB-231 za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, mikroskopii immunofluorescencyjnej, testu mleczanowego, oraz testu na uszkodzenia DNA. Stwierdzono, że dodatek gentamycyny w pożywce zwiększał ekspresję genu czynnika indukującego hipoksję 1 alfa (HIF1a), enzymów glikolitycznych i transporterów glukozy w porównaniu z komórkami hodowanymi w pożywce bez gentamycyny. Gentamycyna zwiększała również produkcję mleczanu i hamowała mitochondrialny potencjał błonowy tych linii komórkowych. Ponadto antybiotyki w pożywkach indukowały mitochondrialne reaktywne formy tlenu powodując uszkodzenia DNA. Stwierdzono wzrost stężenia 8-hydroksy-2-deoksyguanozyny, produktu uszkodzenia oksydacyjnego DNA, w pożywkach linii komórkowych MCF-12A, MCF-7 i MDA-MB-231. Wyniki te wykazały, że prawidłowe komórki nabłonkowe i komórki raka piersi hodowane w podłożu z gentamycyną miały zwiększoną aktywność HIF1a, glikolizę tlenową i uszkodzenia oksydacyjne DNA. Jeśli użyjemy tych niezdrowych komórek w eksperymencie, wszystkie dane będą inne [wypaczone], w porównaniu do komórek hodowanych w mediach bez gentamycyny. Zbadaliśmy szkodliwy wpływ trzech antybiotyków na funkcje mitochondriów w nietransformowanej linii komórkowej MCF-12A oraz w dwóch liniach komórkowych raka sutka MCF-7 i MB-MDA-231. Zmiany metaboliczne we wszystkich liniach komórkowych były dramatycznie różne pomiędzy tymi w podłożu bez antybiotyków a tymi w podłożu zawierającym antybiotyki. Stwierdzono wyraźną różnicę w ekspresji genów enzymów glikolitycznych, produkcji reaktywnych form tlenu i wpływie na potencjał błonowy. Jak na ironię, nasze pierwsze badania zostały przeprowadzone w podłożu zawierającym gentamycynę, a kolejne badania przeprowadzono w podłożu bez gentamycyny. Wyniki były bardzo różne. Celem tego raportu jest podkreślenie, że dane z metabolicznych hodowli komórkowych mogą być niedokładne, ponieważ eksperymenty były przeprowadzane w pożywkach zawierających antybiotyki. Przedstawimy dowody na poparcie tej teorii.” – PLoS One. 2019; 14(4): e0214586; The adverse effect of gentamicin on cell metabolism in three cultured mammary cell lines: “Are cell culture data skewed?” https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6443165/
Zgodnie z najnowszymi publikacjami naukowymi, zanim będziemy mogli mówić o szczepionkach lub rzekomym ludzkim wirusie , musimy podkreślić stosowanie antybiotyków w izolacji i identyfikacji wszystkich ludzkich wirusów, ponieważ antybiotyki są stosowane w hodowlach komórkowych w izolacji potencjalnych wirusów.
Na przykład, penicylina i streptomycyna. Są to antybiotyki bakteriobójcze, o których wiadomo, że powodują dysfunkcję mitochondriów i zmiany w metabolizmie komórkowym. Należy unikać sytuacji, w której negatywny wpływ antybiotyków w postaci uszkodzenia zdrowych komórek laboratoryjnych jest przypisywany potencjalnemu wirusowi podczas eksperymentu izolacji potencjalnego wirusa, aby nie wyciągać błędnych wniosków. Należy unikać stosowania antybiotyków w hodowlach komórkowych. Stosowanie antybiotyków w hodowli komórkowej ma wpływ na ekspresję genów.
„W standardowych wytycznych dotyczących hodowli komórkowych często wykorzystuje się pożywki z dodatkami antybiotyków, aby zapobiec skażeniu komórek. Jednakże stosunkowo niewiele wiadomo na temat wpływu stosowania antybiotyków w hodowlach komórkowych na ekspresję genów i stopnia, w jakim obróbka ta może zakłócić wyniki. Aby kompleksowo scharakteryzować wpływ antybiotykoterapii na ekspresję genów, przeprowadziliśmy sekwencjonowanie RNA i ChIP-Seq (sekwencjonowaniem poprzedzonym immunoprecypitacją chromatyny) dla H3K27ac na komórkach HepG2, linii komórkowej wątroby ludzkiej, powszechnie stosowanej w badaniach farmakokinetycznych, metabolicznych i genomicznych, hodowanych w podłożu uzupełnionym penicyliną-streptomycyną (PenStrep) lub kontrolą nośnika. Zidentyfikowaliśmy 209 genów reagujących na penicylinę-streptomycynę (PenStrep), w tym czynniki transkrypcyjne, takie jak ATF3, które prawdopodobnie wpływają na regulację innych genów. Analiza szlaków wykazała znaczące wzbogacenie dla szlaków “sygnalizacji metabolizmu ksenobiotyków” i “aktywacji PXR/RXR”. Nasza epigenetyczna modyfikacja H3K27ac ChIP-seq zidentyfikowała 9,514 szczytowych wartości, które są wrażliwe na PenStrep. Szczyty te były wzbogacone w pobliżu genów, które funkcjonują w różnicowaniu komórek, modyfikacji tRNA, aktywności nukleaz i deposforylacji białek. Nasze wyniki sugerują, że obróbka penicyliną-streptomycyną (PenStrep), może znacząco zmienić ekspresję i regulację genów w typowych komórkach wątroby, takich jak HepG2, co przemawia za tym, że obróbka antybiotykami powinna być brana pod uwagę podczas przeprowadzania badań genetycznych, genomicznych lub innych badań biologicznych w hodowanych komórkach.” – Sci Rep 7, 7533 (2017); Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation https://www.nature.com/articles/s41598-017-07757-w
Dr Muna Ali jest specjalistą ds. wsparcia naukowego w PromoCell. Zaleca ona unikanie stosowania antybiotyków (np. podczas eksperymentów z covid-19 – Nystadin, penicillin-streptomycin) w hodowlach komórkowych.
„Antybiotyki są rutynowo stosowane w hodowlach komórkowych, aby zapobiegać infekcjom bakteryjnym. Ale są też efekty uboczne: badania wykazują, że upośledzają one wzrost i różnicowanie się komórek. Przy dobrej praktyce laboratoryjnej, stosowanie antybiotyków jest zbędne.
Czy antybiotyki rzeczywiście pomagają w rozwiązaniu problemu zanieczyszczeń, czy też stwarzają dodatkowe, nowe problemy? “Głównym celem stosowania antybiotyków w hodowli komórkowej jest zabijanie bakterii lub hamowanie ich proliferacji…. Jednak łatwo jest zapomnieć, że mogą one również zaszkodzić samym komórkom, ponieważ powodują wiele skutków ubocznych: Na przykład, antybiotyki mogą atakować inne specyficzne, niebakteryjne struktury w komórce.”
Od lat 70-tych do 90-tych, liczne raporty przedstawiały dowody na antyproliferacyjne działanie antybiotyków beta-laktamowych, takich jak penicylina, w hodowlach komórek eukariotycznych (Neftel i in., 1987). Podobne wyniki uzyskano przy stosowaniu aminoglikozydów, takich jak streptomycyna czy gentamycyna (Fischer et al., 1975, Cooper at al., 1990, Cooper et al., 1991). Mimo to, większość grup badawczych nadal włączała antybiotyki do swoich podłoży hodowlanych. “Jednym z powodów, dla których badacze zapominają o skutkach ubocznych antybiotyków jest to, że nie zawsze są one oczywiste. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku stosowania unieśmiertelnionych linii komórkowych, które proliferują w nieskończoność.” – Antibiotics in Cell Culture: Friend or Enemy? https://promocell.com/in-the-lab/antibiotics-in-cell-culture-friend-or-enemy/
Dlaczego zaleca coś takiego? Ponieważ można uzyskać błędne interpretacje. Antybiotyki, które zabijają zdrowe komórki laboratoryjne są używane do udowodnienia zakaźności rzekomego wirusa, podczas gdy rzekomy wirus wcale nie musi istnieć.
– Hodowle komórkowe to komórki pobrane od zwierzęcia lub człowieka i umieszczone w naczyniu laboratoryjnym w celu przeprowadzenia badań naukowych.
– Wirusolodzy zatruwają komórki antybiotykami, a następnie oskarżają rzekomego wirusa o zabicie komórek!
Pozbawianie Składników Odżywczych
Uszkodzenia zdrowych komórek laboratoryjnych spowodowane głodzeniem z powodu pozbawienia ich substancji odżywczych może być błędnie interpretowane jako obecność rzekomego wirusa. Zdrowe komórki laboratoryjne mogą umierać z głodu, a nie z powodu rzekomego wirusa. Pozbawienie substancji odżywczych spowalnia metabolizm komórkowy i replikację komórek, aż w końcu umierają z głodu.
– Drugim czynnikiem jest pozbawienie składników odżywczych.
– Pierwszym czynnikiem jest stosowanie toksycznych antybiotyków (omówione powyżej).
Szczegóły:
Płodowa surowica bydlęca (FBS) zawiera pewne składniki odżywcze niezbędne do wzrostu zdrowych komórek laboratoryjnych. Po zetknięciu się zdrowych komórek laboratoryjnych z rzekomymi komórkami zakaźnymi z gardła, wirusolodzy pozbawiają zdrowe komórki laboratoryjne składników odżywczych o 80%. Mianowicie, przed wprowadzeniem rzekomego wirusa stosuje się pożywkę Dulbecco’s zmodyfikowanego podłoża Eagle’a [DMEM] zawierającą 10% FBS, a po wprowadzeniu rzekomego wirusa stosuje się pożywkę DMEM zawierającą 2% FBS.
Pożywka DMEM jest modyfikacją Basal Medium Eagle (BME), która zawiera wyższe stężenie aminokwasów i witamin oraz dodatkowe składniki uzupełniające. Oryginalna formuła DMEM zawiera 1000 mg/L glukozy i została po raz pierwszy użyta do hodowli mysich komórek embrionalnych.
FBS – płodowa surowica bydlęca (Fetal bovine serum – FBS) jest płynną frakcją skrzepniętej krwi pochodzącej od płodów cielęcych, pozbawioną komórek, fibryny i czynników krzepnięcia, ale zawierającą dużą liczbę czynników odżywczych i wielkocząsteczkowych niezbędnych do wzrostu komórek. Głównym składnikiem FBS jest albumina surowicy bydlęcej. Czynniki wzrostu w FBS są niezbędne do utrzymania i wzrostu hodowanych komórek. FBS zawiera również różne małe cząsteczki, takie jak aminokwasy, cukry, lipidy i hormony.
„Pandemia COVID-19 wywołana przez koronawirus SARS-CoV-2 wymaga wiarygodnych testów do badania mechanizmów wejścia wirusa, które pozostają słabo poznane. Wiedza ta jest ważna dla rozwoju metod terapeutycznych w celu kontrolowania infekcji SARS-CoV-2 poprzez umożliwienie poszukiwania przeciwciał neutralizujących i innych czynników, które mogą blokować infekcję… System ten jest wydajny (generowanie wirusa, miareczkowanie i badania infekcji mogą być przeprowadzone w ciągu 1 tygodnia), ilościowy, niedrogi i łatwo skalowalny do zastosowania w rozwoju leków i badaniach terapeutycznych.” – Front Cardiovasc Med. 2020; 7: 618651; Generation of SARS-CoV-2 Spike Pseudotyped Virus for Viral Entry and Neutralization Assays: A 1-Week Protocol https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7843445/
„Wyizolowaliśmy SARS-CoV-2 od 2 zakażonych pacjentów z Toronto w Kanadzie, określiliśmy sekwencje genomowe i zidentyfikowaliśmy zmiany pojedynczych nukleotydów w reprezentatywnych populacjach naszych zapasów wirusa. Przetestowaliśmy również szeroki zakres ludzkich komórek odpornościowych pod kątem produktywnego zakażenia SARS-CoV-2. Potwierdzamy, że ludzkie pierwotne komórki jednojądrzaste krwi obwodowej nie są przepuszczalne dla SARS-CoV-2. Ponieważ SARS-CoV-2 nadal rozprzestrzenia się globalnie, istotne jest monitorowanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w wirusie i kontynuowanie izolacji krążących wirusów w celu określenia genotypu i fenotypu wirusa przy użyciu modeli infekcji in vitro i in vivo.” – Emerg Infect Dis. 2020 Sep; 26(9): 2054–2063; Isolation, Sequence, Infectivity, and Replication Kinetics of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7454076/
W momencie wstrzyknięcia rzekomego materiału zakaźnego z gardeł rzekomo zakażonych osób do zdrowych komórek laboratoryjnych, zagłodzili oni zdrowe komórki laboratoryjne pozbawiając je składników odżywczych.
Ponadto zdrowe komórki laboratoryjne zostały wcześniej zatrute antybiotykami. Po zatruciu i pozbawieniu substancji odżywczych zdrowe komórki laboratoryjne uległy ogromnym uszkodzeniom. Toksyczne działanie antybiotyków może nasilać się w następujący sposób. Mianowicie, surowica użyta przed rozpoczęciem eksperymentu wynosi 10%, a po rozpoczęciu eksperymentu 2%. Surowica ta zawiera białko albuminę, która blokuje działanie antybiotyków. Na tej podstawie dochodzimy do wniosku, że zmniejszając ilość surowicy o 80%, ilość albuminy jest znacznie zmniejszona, antybiotyki są blokowane w mniejszym stopniu, co potęguje toksyczne działanie antybiotyków.
Są to wszystko wsteczne siły naukowe oparte na eksperymentach z 1945 roku. Widać to po tym, że nie wskazali oni negatywnego eksperymentu kontrolnego.
Gdyby przeprowadzili negatywny eksperyment kontrolny, prawdopodobnie zobaczyliby, że nie było żadnej infekcji ani wirusa i że błędnie interpretowali wyniki eksperymentu. Praca naukowa nie może być uznana za naukową, jeśli nie ma eksperymentu kontrolnego bez badanego czynnika zakaźnego.
Oszustwo zostało potwierdzone: Testy PCR nie wykrywają SARS-CoV-2
Chociaż nie wyizolowali domniemanego wirusa odpowiedzialnego za Covid-19, nadal zajmowali się uszkodzonymi komórkami i izolowali części uszkodzonych komórek, a następnie przedstawiali te części jako elementy wirusa.