Spontaniczna integracja fragmentów ludzkiego DNA w genomie biorcy – dr Theresa A. Deisher, Kumiko Koyama

 

Poniższa publikacja dr T. Deisher i K. Koyama została opublikowana w 2012 roku. Warto poznać jakieś tło dla tego badania. Kilka lat wcześniej, a dokładnie w 2005 roku miało miejsce spotkanie Komitetu Doradczego ds. Szczepionek i Innych Produktów Biologicznych (Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee) podczas którego dr Keith Peden pracujący dla Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków [FDA] przekazał kilka ciekawych informacji w swojej prezentacji. Prezentacja miała tytuł “Problemy związane z resztkowym DNA komórek-substratu” Issues Associated With ResidualCell-Substrate DNA – Keith Peden. Jeszcze do 2018 roku była dostępna na oficjalnej stronie FDA, ale już nie jest. Została zachowana kopia na portalu Web Archive.

Z ciekawostek w tej prezentacji mamy np. na stronie nr 3 o tym, jak w 1986 roku WHO ustanowiło limit DNA w szczepionkach na ≤100 pg na dawkę, a w 1996 został on podniesiony do ≤10 ng na dawkę (producenci nie byli w stanie sprostać poprzednim wymaganiom). Potem na str. 8 o nowotworowych właściwościach jako konsekwencji integracji obcego DNA do genomu odbiorcy i zaburzaniu genów supresorowych, zdolności do generowania czynników zakaźnych jak retrowirusy (i podane są badania na ten temat od str. 14) i na koniec stwierdzają, że brakuje długoterminowych badań bezpieczeństwa na ludziach, więc wraz z upływem czasu i zbieraniem nowych danych mogą nastąpić zmiany w zaleceniach ( = eksperymenty na dzieciach).

Prawda o komórkach macierzystych – wywiad z dr Theresą Deisher
Dr Theresa Deisher – DNA abortowanych płodów, retrowirusy, super adjuwanty
Wywiad z dr Stefanem Lanka o błędach metodologicznych w izolowaniu wirusów

Spontaniczna integracja fragmentów ludzkiego DNA w genomie biorcy

 

Wstęp

W trzech niedawnych artykułach w czasopiśmie NEURON mówi się o obecności setek różnorodnych mutacji genowych de novo, wskazujących, że zaburzenia autyzmu (ang. autism spectrum disorder, ASD) może być chorobą powodowaną przez niestabilność genomową wraz ze znaczącym czynnikiem środowiskowym. Zmodyfikowane powstawanie pęknięć dwuniciowego DNA i ścieżek naprawy (ang. double-strand break, DSB) może być powszechne dla rozmaitych mutacji genetycznych, które udokumentowano w przypadku autyzmu. W Stanach Zjednoczonych wyraźne [punkty] zmiany w skutkach szczepień dla autyzmu odnotowano u dzieci urodzonych w latach 1980, 1988 i 1996, co pokrywa się z przejściem na lub wprowadzeniem szczepionek dla dzieci zanieczyszczonych ludzkim retrowirusem endogennym K (ang. human endogenous retrovirus K, HERVK) i fragmentami DNA ludzkich płodów^[6].  Stawiamy hipotezę, że HERVK i zanieczyszczenia w postaci DNA ludzkich płodów mogą przyczyniać się do niestabilności genomowej występującej w autyzmie, jak na to wskazują mutacje de novo.

DNA wolne od komórki może być wchłonięte przez zdrowe komórki na drodze wychwytu z udziałem receptorów lub też może spontanicznie przenikać przez błony komórkowe o zmodyfikowanej przepuszczalności na przykład w czasie reakcji zapalnych. Uważa się, że wchłanianie przez jądro komórkowe fragmentów DNA wolnych od komórek stanowi źródło utrzymania integralności DNA podczas ratowania zablokowanych widełek replikacyjnych bądź naprawy uszkodzeń zasad w DNA. Spontaniczne pozakomórkowe wchłanianie DNA jest także wykorzystywane w terapii genowej, jak również w naprawie zmian w cząsteczkach DNA w żywej komórce^{[2, 4, 5, 7, 8 i 9]}. Chociaż wykorzystywanie wchłaniania wolnego DNA przynosi korzyści, proces ten wiąże się też z powstawaniem mutacji oraz aberracji chromosomowych^[3].

Szczepionki produkowane z użyciem linii komórkowych pochodzących od ludzkich płodów zawierają resztki fragmentów DNA (50-500 par zasad) (Tabela I). Możliwe, że te zanieczyszczające fragmenty mogą włączać się do genomu dziecka i zaburzać normalne funkcjonowanie genów, prowadząc do powstania fenotypu autyzmu. W niniejszym badaniu przedstawiamy proces wchłaniania obcego DNA przez ludzkie komórki oraz integrację genomu poprzez inkubowanie komórek w barwionych Cy-3 fragmentach DNA Cot1 człowieka (łożyskowych), reprezentujących zanieczyszczające resztki DNA ludzkich płodów w szczepionkach.

 

Tabela 1. Poziomy resztek ludzkiego dwuniciowego DNA (test PicoGreen) i ludzkiego jednoniciowego DNA (test OliGreen) w szczepionce przeciwko różyczce (Meruvax II) i przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu A (HAVRIX).

Nazwa szczepionki	Dwuniciowe DNA (ng/dawka-fiolka)	Jednoniciowe DNA (ng/dawke-fiolka)	Długość (pary zasad)
Meruvax II (różyczka)	142.05	35.00	240
HAVRIX (WZW A)	276.00	35.74	Niemożliwa do zmierzenia

 

Materiały i metody: DNA Cot1 człowieka (Invitrogen) zostało oznaczone z użyciem zestawu do znakowania Mirus Label IT Cy™3 Labeling Kit producenta Mirus.

Komórki U937 (monocyty) zostały wyhodowane na modyfikowanej pożywce Eagle’a Dublecco (ang. Dublecco modified Eagle’s medium, DMEM) uzupełnionej o 15% serum płodowe z cieląt (ang. fetal bovine serum, FBS) i 1% roztwór antybiotyczny i przeciwgrzybiczny w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% C0₂/95% powietrza. Komórki HL-60 (mieloblasty) zostały wyhodowane na pożywce Dublecco w modyfikacji Iscove’a (ang. Iscove’s modified Dublecco’s medium, IMDM) uzupełnionej o 20% FBS oraz 1% roztwór antybiotyczny i przeciwgrzybiczny w temperaturze 37°C w tych samych warunkach. 750ng barwionego Cy-3 DNA Cot1 człowieka było inkubowane per 1.0×10⁷ komórek przez 24 godziny i 48 godzin.

Proces wchłaniania DNA przez komórki i jądro komórkowe został zbadany pod mikroskopem fluorescencyjnym. DNA genomowe komórek U937 zostało oczyszczone poprzez wytrącanie etanolem, co umożliwiło usunięcie krótkiego fragmentu kwasów nukleinowych łącznie z niewłączonym barwionym Cy-3 DNA Cot1 człowieka. Ilość barwionego Cy-3 DNA Cot1 człowieka przyłączonego do chromosomów U937 została obliczona z wykorzystaniem względnej jednostki fluorescencji (RFU) zmierzonej za pomocą fluorymetru.

Luźno przylegające komórki NCCIT (potworniakorakowe) zostały wyhodowane przy gęstości komórek 3×10⁴ na płytkę w płytce 24-dołkowej, zaś na każdej płytce umieszczono szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% C0₂/95% powietrza. Komórki HFF1 (ludzkie komórki fibroblastów napletka 1) zostały wyhodowane w tych samych warunkach, z tym że jako podłoża użyto pożywki DMEM uzupełnionej o 15% serum płodowe z cieląt (FBS) i 1% roztwór antybiotyczny i przeciwgrzybiczny.

 

Metody i wyniki

 

Komórki BE (2)-C (neuroblastoma) zostały wyhodowane w tych samych warunkach, z tym że zastosowanym podłożem była mieszanina 1:1 pożywki hodowlanej Eagle’a (EMEM) i pożywki F12 uzupełniona o 10% FBS oraz 1% roztwór antybiotyczny i przeciwgrzybiczny.

Komórki M059K (komórki skuteczne w naprawie uszkodzenia obu nici DNA glejaka) i M059J (komórki nieskuteczne w naprawie uszkodzenia obu nici DNA glejaka) zostały także wyhodowane w tych samych warunkach, z tym, że zastosowanym podłożem była mieszanina 1:1 pożywek DMEM i Hama F12 uzupełniona o 10% FBS, 0,05mM nie niezbędnych aminokwasów i 1% roztwór antybiotyczny i przeciwgrzybiczny. Komórki hodowano w każdym z tych środowisk przez 2 do 3 dni, a następnie dodano 500ng barwionego Cy-3 DNA Cot1 człowieka i inkubowano w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% C0₂/95% powietrza, delikatnie potrząsając przez 24 i 48 godzin. Po zakończeniu inkubacji, jądro komórkowe zabarwiono barwnikiem Hoechst, na szklanych płytkach umieszczono szkiełka nakrywkowe i za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przeanalizowano proces wchłaniania DNA przez komórki i jądro komórkowe.

W celu zbudowania modelu stanu zapalnego, wszystkie przylegające linie komórkowe zostały aktywowane przez lipopolisacharyd (LPS). Sprawdzono również permeabilizację saponiną w komórkach HFF1. Na płytkach sprawdzono trzy stężenia LPS, 1 ng/10⁴ komórek, 10ng/10⁴ komórek i 100ng/10⁴ komórek każdej wymienionej powyżej linii komórkowej. Komórki inkubowano barwionym Cy-3 DNA Cot1 człowieka oraz LPS w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% C0²/95% powietrza, delikatnie potrząsając przez 24 i 48 godzin. Podobnie jak komórki inkubowane bez LPS, komórki te również zabarwiono barwnikiem Hoechst przed przeanalizowaniem procesu wchłaniania DNA przez komórki i jądro komórkowe za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Komórki HFF1 inkubowano 0,02% saponiny, 300ng DAPI i 500ng barwionego Cy-3 DNA Cot1 człowieka przez 24, 48 i 72 godziny. Komórki także poddano obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Wyniki (Tabela 2):

Spontaniczne wchłanianie DNA przez komórki i jądro komórkowe było wyraźne w komórkach HFF1, NCCIT i U937 (Ryc. 1, 3, 7 i 8). Nie było możliwości zmierzenia wchłaniania DNA przez komórki BE (2)-C oraz M059K ze względu na wysoką autofluorescencję tych komórek. Barwienie Cy-3 nie dało sygnału w komórkach HL-60. W przypadku zapalenia wywołanego przez LPS, zaobserwowano wchłanianie DNA przez komórki HFF1, NCCIT, M059J oraz U937 (Ryc. 2, 4, 5 i 6).

Ilość barwionego Cy-3 DNA Cot1 człowieka włączonego do DNA genomowego komórek U937 wyniosła 0,0111 +/- 0,0034pg (n=12) na komórkę w ciągu 24 godzin, czyli w przybliżeniu 0,167% łącznego DNA genomowego komórek U937.

Ilość DNA włączonego do komórek NCCIT wyniosła 0,0026pg/komórkę w ciągu 24 godzin i 0,04pg/komórkę w ciągu 48 godzin, co stanowi 0,06% łącznego DNA genomowego komórek NCCIT.

 

Tabela 2: Wchłanianie DNA przez różne linie komórkowe

	Spontaniczne wchłanianie przez komórki	Spontaniczne wchłanianie przez jądro komórkowe	Włączenie do DNA genomowego	Wchłanianie przez komórki/jądro komórkowe z zastosowaniem LPS lub saponiny
HFF1	Tak	Tak	Nie wykonano	Wzrost/Wzrost
NCCIT	Tak	Tak (zmienne)	0,0026pg na komórkę 24 godz. 0,04pg na komórkę 48 godz.	Bez zmian/Bez zmian
BE(2)-C	Nie	Nie	Nie wykonano	Nie/Nie
M059K	Nie	Nie	Nie	Nie/Nie
M059J	Nie	Nie	Nie wykonano	Tak/Nie
U937	Tak	Tak	0,011 +/- 0,003pg na komórkę 24 godz.	Bez zmian/Bez zmian
HL60	Nie	Nie	Nie	Nie

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Omówienie

            Zmierzone przez nas przyłączenie się (0,003 do 0,04 pg) 0,2% – 0,6% całego genomu w ciągu 24 do 48 godzin wydaje się wysokie na pierwszy  rzut oka. Nasze liczby zgadzają się jednak z wcześniejszymi raportami, dowodzącymi, że w badaniach egzogenne DNA zastępowało do 1% całego genomu w ciągu 30 minut^[6]. Mimo że w naszych eksperymentach komórki HL-60 nie wchłonęły egzogennego DNA spontanicznie, ta linia komórkowa wykorzystywana była w przeszłości jako model spontanicznego wchłaniania DNA^[8].

Wchłanianie DNA przez komórki i jądro ludzkich komórek fibroblastów napletka (HFF1) oraz komórek NCCIT wskazuje, że komórki zarodkowe i komórki noworodka są bardziej podatne na wchłanianie DNA niż komórki z dojrzalszego źródła. Wyniki te wskazują na potrzebę przeprowadzenia dalszych badań nad przyłączaniem DNA z egzogennych źródeł umożliwiających porównanie podatności niemowląt i małych dzieci z podatnością nastolatków i dorosłych.

Zwiększone wchłanianie DNA po aktywacji przez LPS wskazuje, że ogólnoustrojowy stan zapalny lub odpowiedzi immunologiczne mogą nasilić podatność na wchłanianie egzogennego DNA. Szczepionki wyprodukowane z użyciem ludzkich komórek diploidalnych są zanieczyszczone przez fragmenty egzogennego DNA i retrowirusy, a szczepionki aktywizują ogólnoustrojowy stan zapalny i odpowiedź immunologiczną. Wśród naszych przyszłych celów badawczych znajdują się zlokalizowanie obszarów integracji DNA, przedstawienie zmian fenotypowych wywołanych przez integrację obcego DNA w liniach komórkowych zależnych od czynnika, jak też ustalenie aktywności biologicznej i/lub patologicznej fragmentów ludzkiego retrowirusa endogennego K (HERVK) znajdujących się w szczepionkach.

 

Tabela 3: Opis komórek

Komórki	Źródło	Morfologia	Gospodarz transfekcji
U937	Chłoniak histiocytarny	Monocyt	Tak
HL60	Białaczka	Mieloblast	Tak
BE(2)C	Neuroblastoma	Neuroblast	Nie
M059K	Glejak	Fibroblast	Nie
M059J	Glejak	Fibroblast	Nie
HFF1	Napletek	Fibroblast	Nie

Wnioski

Nie tylko uszkodzone, ale także zdrowe ludzkie komórki mogą spontanicznie wchłonąć obce DNA. Obce DNA człowieka wchłonięte przez ludzkie komórki transportowane jest do jądra komórkowego i włączane do genomu gospodarza, co powoduje zmianę fenotypową. Z tego powodu resztki fragmentów DNA z ludzkich płodów w szczepionkach mogą być jedną z przyczyn autyzmu u szczepionych dzieci.

Szczepionki muszą być bezpieczne, czyli nie mogą zawierać żadnych zanieczyszczeń w postaci ludzkiego DNA ani wirusów reaktywowanych, a przy ich wytwarzaniu należy stosować etycznie zatwierdzone procesy produkcji.

 

Przypisy:

1. Golan M, Hizi A, Resau J, Yaa-Hahoshen, Reichman H, Keydar lafa, and Ian Tsarfaty. “Human Endogenous Retrovirus (HERV-K) Reverse Transcriptase as a Breast Cancer Prognostic Marker” NEO PLASIA, Vol.10, No.6, June 2008, pp. 521-533.
2. Filaci G, Gerloni M, Rizzi M, Castiglion P, Chang H-D, Wheeler MC, Fiocca R, and Zanetti M. “Spontaneous transgenesis of human B lymphocytes.” Gene therapy, 2004, 11, 42-52.
3. Howe S, Mansour M, Schwarzwaelder K, Bartholomae C, Hubank M, Kempski H, Brugman M, PikeOverzet K, Chatters S, Ridder D, Gilmour K, Adams S, Thomhil S, and other 14. “Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy.” Journal od Clinical Investigation. Vol 118, No.9, September 2008.
4. Lehmann MJ, and Sczakiel G. “Spontaneous uptake of biologically active recombinant DNA by mammalian cells via a selected DNA segment.” Gene Therapu 2005, 12, 446-451.
5. Rogachev V, Likhacheva A, Vratskikh O, Mechetina L, Sebeleva T, Bogachev S, Yakubov L, and Shurdov M. “Qualitative and quantitative characteristics of the extracellular DNA delivered to the nucleus of a living cell” Cancer Cell International, October 2006, 6:23, P1475-2867.
6. Victoria J, Wang C, Jones M, Jaing C, McLoughlin K, Gardner S, and Delwart E. “Viral Nucleic Acids in Live-Attenuated Vaccinces: Detection of Minority Variants and an Adventitious Virus.” Journal of Virology, June 2010, P.6033-6040.
7. Yakubov L, Deeva E, Zarytova V, Ivanova E, Ryte A, Yurchenko L, and Vlassov V. “Mechanism of Oligonucleotide uptake by cells: , September Involvement of specific receptors?” Proceedings of the National Academy of Science, Vol. 86, pp 6454-6458, September 1989.
8. Yakubov A, Petrova N, Popova N, Semenov D, Nikolin V, and Os’kina I. “The Role of Extracellular DNA in the Stability and Variability of Cell Genomes.” Doklady Biochemistry and Biophysics, Vol. 382, 2002, pp.31-34.
9. Yakubov L, Rgachev V, Likhacheva A, Bogachev S, Sebeleva T, Shilov A, Baiborodin S, Petrova N, Mechetina L, Shurdov M, and Wickstrom E. “Natural Human Gene Correction by Small Extracellular Genomic DNA Fragments.” Cell Cycle 6:18, 2293-2301, 15 September 2007.

Podziękowania: Niniejsze badanie zostało sfinansowane z funduszu charytatywnego M.J. Murdocka oraz z prywatnych dotacji. Spontaniczna integracja fragmentów ludzkiego DNA w genomie biorcy

 

Źródło: Spontaneous Integration of Human DNA Fragments into Host Genome – K. Koyama, T. A. Deisher

 

Dr Theresa Deisher, inżynier genetyczny – kariera zawodowa

 

Sound Choice Pharmaceutical Institute (SCPI) to nowoczesna organizacja zajmująca się badaniami biomedycznymi. Jej prezesem jest dr Theresa Deisher, inżynier genetyczny, która zanim założyła SCPI jako organizację non-profit, miała ponad 20-letnie doświadczenie w branży farmaceutycznej, od podstawowej biologii człowieka po badania kliniczne. Od 1993 roku zajmuje się inżynierią genetyczną w celu opracowania procesów terapeutycznych. Odkryła komórki macierzyste u dorosłych oraz pracowała nad ich potencjalnymi zastosowaniami terapeutycznymi. W wyniku tej pracy jej nazwisko widnieje na 23 patentach jako wynalazca. Pod jej przewodnictwem organizacja SCPI:

• Bada zdrowotne i patologiczne konsekwencje występowania szczątkowego płodowego ludzkiego DNA, resztek komórkowych oraz retrowirusów w naszych lekach.
• Informuje na temat powszechnie wykorzystywanego płodowego materiału ludzkiego w odkrywaniu, rozwoju i komercjalizacji medykamentów, a także promuje świadomość praw każdego konsumenta, aby wiedział, co znajduje się w produktach przez niego stosowanych, w tym pozostałości ludzkiego DNA.
• Wspiera osiągnięcia zdobyte w badaniach nad dorosłymi komórkami macierzystymi.
• Prowadzi badania i opracowuje produkty, w tym alternatywne linie komórkowe do produkcji szczepionek.
• Stosuje metody naukowe, które są zgodne z misją SCPI w celu zakończenia handlu ludźmi i ich wykorzystywania do celów badań biomedycznych oraz opracowywania produktów komercyjnych.

Kariera T. Deisher koncentruje się na odkrywaniu i opracowywaniu nowych metod leczenia poważnych chorób u ludzi. Dr Deisher uzyskała tytuł doktora w dziedzinie fizjologii molekularnej i komórkowej na Uniwersytecie Stanforda i spędziła ponad 20 lat w komercyjnej biotechnologii. Przed założeniem AVM Biotechnology i Sound Choice Pharmaceutical Institute (SCPI) współpracowała z wiodącymi firmami biotechnologicznymi, w tym Genentech, Repligen, ZymoGenetics, Immunex i Amgen. AVM Biotechnology jest firmą biotechnologiczną promującą podejście prolife na całym świecie, zaświadczającą, że nie wykorzystuje materiałów moralnie niedozwolonych na jakimkolwiek etapie swojej działalności. Misją SCPI jest zaprzestanie handlu ludźmi w badaniach biomedycznych.

Dr T. Deisher jest wynalazcą w 23 zatwierdzonych patentach w USA, a jej odkrycia doprowadziły do badań klinicznych FGF18 w leczeniu zapalenia kości i stawów oraz odbudowy tkanki chrząstnej, a także czynnika XIII w krwawieniu chirurgicznym. Dr T. Deisher była pierwszą osobą, która odkryła sercowe komórki macierzyste u dorosłych i od dwóch dekad jest mistrzem w badaniach nad dorosłymi komórkami macierzystymi, zarówno zawodowo, jak i prywatnie. Dr T. Deisher była skarżącym w amerykańskim pozwie federalnym, w którym chodziło oto, aby zakazać wykorzystywania federalnych pieniędzy podatników do badań w których niszczone są embriony ludzkie, co miało zasadnicze znaczenie dla ukierunkowania nauki na badania nad dorosłymi komórkami macierzystymi. W konsekwencji doprowadziło to do otrzymania 14 zatwierdzonych przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków [FDA] produktów na bazie dorosłych komórek macierzystych oraz nagłówka w Washington Post z grudnia 2013 “Scientists Go Ethical in 2013”.

Źródło:  About Us – Sound Choice Pharmaceutical Institute (SCPI)

 

Zobacz na: Niespecyficzne skutki szczepień cz.1 – dr Suzanne Humphries
Niespecyficzne skutki szczepień cz.2 – dr Suzanne Humphries
Mechanizm powstawania i wzrostu nowotworów złośliwych – dr Alexis Carrel
Długotrwały wpływ na zdrowie szczepień wieloma antygenami – Odtajniony Raport armii USA
Szczepionki na bazie linii komórkowych z aborcji a rodzina katolicka. Perspektywa moralna i historyczna. cz.1
Napletki noworodków są używane do produkcji szczepionek
Planned Parenthood sprzedaje części ciała abortowanych dzieci dla zysku [nagranie z ukrytej kamery]