STRESZCZENIE

W pracy omówiono obowiązujące zalecenia Farmakopei Europejskiej i Europejskiej Agencji Leków dotyczące ograniczania zanieczyszczeń czynnikami zewnątrzpochodnymi tj. wirusami pochodzącymi z materiałów biologicznych, stosowanych w procesie wytwarzania szczepionek. Zgodnie z obowiązującymi zaleceniami, w celu potwierdzenia nieobecności w szczepionkach wirusowych potencjalnych zanieczyszczeń wykorzystywane są badania obecności wirusów metodami in vivo oraz in vitro, PCR oraz z zastosowaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zakres obowiązujących badań bezpieczeństwa szczepionek zgodnie z aktualnym stanem wiedzy, może jednak nie być wystarczający we wszystkich przypadkach. Poprawę możliwości wykrywania potencjalnych czynników zewnątrzpochodnych, zwłaszcza wirusowych można uzyskać przez zastosowanie nowoczesnych i zwalidowanych metod badawczych, takich jak analizy metagenomu szczepionek, sekwencjonowanie nowej generacji, analizy na mikronośnikach DNA, PCR w czasie rzeczywistym i masowej spektrometrii elektronowej. Dotychczas zastosowanie nowoczesnych narzędzi badawczych tj. sekwencjonowanie DNA umożliwiło wykrycie nieoczekiwanej obecności cirkowirusów PCV 1 i PCV 2 w szczepionkach przeciw rotawirusom. Rutynowe wprowadzenie rozszerzonych badań bezpieczeństwa szczepionek przez wykrywanie potencjalnych i wcześniej niewykrywanych zanieczyszczeń wirusowych zależeć będzie w najbliższym czasie od decyzji instytucji do tego celu upoważnionych.

WSTĘP

O bezpieczeństwie stosowanych szczepionek decydują m. in. badania prowadzone już w trakcie produkcji, tzn. kontrola na różnych etapach wytwarzania, zwalnianie serii do stosowania po sprawdzeniu zgodności z wymogami przez wytwórców i instytucje do tego celu upoważnione i wreszcie monitorowanie bezpieczeństwa po wprowadzeniu do obrotu (1). Badania bezpieczeństwa szczepionek wirusowych obejmują m.in. ocenę obecności tzw. czynników ze- wnątrzpochodnych, czyli potencjalnych zanieczyszczeń drobnoustrojami, które z różnych względów nie zostały skutecznie wyeliminowane z materiałów pochodzenia biologicznego, stosowanych w procesie wytwarzania lub które pochodzą z przypadkowych zanieczyszczeń w przebiegu tego procesu (2, 3). Źródłem mikrobiologicznych zanieczyszczeń szczepionek związanych ze stosowaniem materiałów pochodzenia biologicznego mogą być szczepy szczepionkowe wirusów, których serie siewne zostały przygotowane w liniach komórek, względnie linie komórek lub materiały stosowane jako składniki podłoży hodowlanych np. surowica bydlęca, świńska lub trypsyna. Zakres prowadzonych badań czynników zewnątrzpochodnych w tym przypadku obejmuje pochodzenie stosowanych w procesie wytwarzania linii komórek, a w przypadku szczepionek weterynaryjnych dodatkowo gatunek zwierzęcia, dla którego przeznaczona jest szczepionka (4). Wybór metod i zakresu badań czynników zewnątrzpochod- nych w obecnie stosowanych szczepionkach jest ściśle związany z aktualną wiedzą o poznanych, a wcześniej niezidentyfikowanych drobnoustrojach, które mogą być potencjalnie zakaźne dla linii komórek stosowanych w procesie wytwarzania szczepionki. Na zakres tych badań wpływają także zmiany dokonywane w procesie wytwarzania szczepionek, takie jak np. wprowadzenie do namnażania wirusa grypy ciągłych linii komórek pochodzących od ssaków, tj. linii komórek nerki psa MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) oraz linii Vero, nerki afrykańskiej małpy zielonej, zamiast zalężonych jaj kur. Podobnie, w przypadkach nowo opracowywanych szczepionek, do wytwarzania których używane są wcześniej niestosowane powszechnie linie komórek np. ssaków lub owadów, zakres tych badań musi być odpowiednio szeroki oraz zgodny z aktualnym stanem wiedzy (5).
Przy omawianiu roli potencjalnych zanieczyszczeń wirusowych w aspekcie bezpieczeństwa szczepionek należy nadmienić, że do potencjalnych niewirusowych zanieczyszczeń zalicza się grzyby i bakterie, w tym mykoplazmy, spiroplazmy, prątki, riketsje, a nawet przedstawicieli pierwotniaków i innych pasożytów. Do zanieczyszczeń zalicza się także białka prionowe
powodujące pasażowalne encefalopatie gąbczaste TSE (Transmissible Spongiform Encephalopathy) (2, 6, 7). Procesy wytwarzania szczepionek są na obecnym etapie na tyle zoptymalizowane, że w/w czynniki nie stanowią zasadniczego problemu, ponieważ ich obecność jest skutecznie eliminowana na odpowiednich etapach procesu wytwarzania, co znajduje potwierdzenie na wielu etapach kontroli jakości (2).
Wobec różnorodności drobnoustrojów potencjalnie nadkażających szczepionki oraz postępu wiedzy na temat występowania wielu nieznanych jeszcze wirusów, które mogą stanowić potencjalne ich zanieczyszczenie, trudno jest jednoznacznie zdefiniować wystarczający zakres badań, który zapewniłby bezpieczeństwo substancji biologicznych zastosowanych do wytwarzania szczepionek. Z szacowanej liczby 150 000 istniejących wirusów, jak dotąd zidentyfikowano jedynie ok. 2300 i liczby te mogą ulegać zmianie (8). Z tych względów analiza bezpieczeństwa szczepionek pod względem potwierdzenia braku obecności czynników zewnątrz- pochodnych czy zanieczyszczeń biologicznych praktycznie uwzględnia oznaczenie jedynie potencjalnego ryzyka. Tak więc zakres badań powinien być na bieżąco modyfikowany zgodnie z aktualnym stanem wiedzy na temat tzw. nowo zidentyfikowanych wirusów lub czynników potencjalnie zakażających (8, 9).
Zanieczyszczeniem wirusowym potencjalnie stano-wiącym czynnik zewnątrzpochodny mogą być: cząstki wirusów, białek lub materiału genetycznego innego niż wirus szczepionkowy. Z tych względów wirusowe czynniki zewnątrzpochodne zostały podzielone na trzy kategorie;
– „known known” – znane wirusy, których obecności możemy oczekiwać w określonym materiale biologicznym, jak np. wirus wirusowej biegunki bydlęcej BVDV (Bovine Viral Diarrhea Virus), który potencjalnie może być obecny w surowicy uzyskanej od bydła pochodzącego z obszarów endemicznych,
– „known unknown” – nieznane wirusy, które można wykryć metodami konwencjonalnymi,
– „unknown unknown”– nowo wykryte wirusy, których nie można wykryć konwencjonalnymi metodami badawczymi, np. opisany ostatnio bydlęcy wirus polyoma i wirus Torque Teno (10, 11).
Skutki zanieczyszczeń czynnikami zewnątrzpo- chodnymi w szczepionkach mogą być uzależnione od patogenności czynnika zakaźnego, wielkości samego zanieczyszczenia (np. miana wirusa stanowiącego czynnik zewnątrzpochodny) lub stopnia jego inaktywa- cji. U ludzi lub zwierząt zaszczepionych szczepionką zanieczyszczoną wirusowym czynnikiem zewnątrzpochodnym może dojść do zakażenia bezobjawowego lub zakażenia z różnie nasilonymi objawami (2, 3).

RYS HISTORYCZNY BADAŃ NAD ZEWNĄTRZPOCHODNYMI CZYNNIKAMI ZANIECZYSZCZEŃ

Badania oceny bezpieczeństwa szczepionek pod względem zanieczyszczeń wirusami rozpoczęto wraz z wprowadzeniem linii komórek stosowanych do na- mnażania wirusów w procesach wytwarzania szczepionek. Już w latach 50-tych zidentyfikowano wirusy, które mogły zakażać niektóre linie komórek, jak np. wirus „foamy virus” (Spumaretrovirinae) powodujący niszczenie zastosowanych pierwotnych linii komórek nerki małpy, czy też kaliciwirus, który niszczył linie komórek nerki chomika CHO (Chinese Hamster Ovary) (2, 12).
Jedno z pierwszych doniesień o negatywnym wpływie zanieczyszczeń czynnikami zewnątrzpochodnymi szczepionek na zdrowie osób dotyczyło zanieczyszczenia wirusem zapalenia wątroby typu B szczepionki przeciw żółtej gorączce, podawanej w 1942 r. żołnierzom amerykańskim (12). Nie tak groźne konsekwencje miało zastosowanie szczepionki przeciw żółtej gorączce, przy-gotowanej z użyciem zarodków kurzych, zakażonych cząstkami wirusa białaczek ptasich ALV (Avian Leuco¬sis Virus) i endogennym wirusem ptasim AEV (Avian Endogenous Virus). Badania osób zaszczepionych tą szczepionką nie potwierdziły serokonwersji wobec wirusów zanieczyszczających ani ich patogenności dla człowieka (12).
Pierwsze komercyjnie dostępne i stosowane w latach 50-tych szczepionki przeciw poliomyelitis przygotowane w pierwotnych liniach komórek pochodzących od nerki małpy Rhesus, były zakażone wirusem małpy SV40 (Simian Virus 40). Fakt ten opisano dopiero w 1959 r., po tym jak analizy jakościowe serii szczepionek przeciw poliomyelitis wyprodukowanych w latach 1954-1963 potwierdziły obecność tego zanieczyszczenia. Ocenia się, że w tym okresie w Stanach Zjednoczonych szczepionki potencjalnie zanieczyszczone wirusem SV40 podano ponad 100 mln osób. Mimo, że do dzisiaj nie potwierdzono onkogennych właściwości wirusa SV40 u ludzi (12, 13), w 1961 r. do zakresu obowiązkowych badań bezpieczeństwa każdej serii szczepionki przeciw poliomyelitis wprowadzono badanie jego obecności w linii komórek stosowanej do namnażania wirusów polio. Ze względu na wysokie ryzyko występowania nadkażeń pierwotnych linii komórek nerki małpy Rhesus wirusem SV40 oraz innymi wirusami małpimi, w 1963 r. do namnażania wirusów polio w procesie wytwarzania szczepionek wprowadzono pierwotną linię komórek nerki małpy Cercopithecus, wolną od wirusa SV40. Obecnie szczepionki produkowane z użyciem w/w linii komórek małpy są obligatoryjnie poddawane rozszerzonym wówczas badaniom kontroli. Potencjalne ryzyko zanieczyszczenia
związane z materiałem siewnym lub linią komórek zostało także ograniczone przez wprowadzenie do procesu wytwarzania zwalidowanego systemu serii siewnych oraz banków komórek (7, 14).

AKTUALNE WYMAGANIA DOTYCZĄCE KONTROLI CZYNNIKÓW ZEWNĄTRZPOCHODNYCH

Stwierdzanie zanieczyszczeń w różnych szczepion-kach spowodowało, że zespoły naukowe wytwórców oraz instytucji upoważnionych do kontroli opracowały szczegółowe wymagania rozszerzonej oceny bezpie-czeństwa szczepionek, które uwzględniały również prawdopodobne zanieczyszczenia czynnikami wiruso-wymi. Podstawą obowiązujących regulacji dotyczących bezpieczeństwa produktów leczniczych stosowanych u ludzi i zwierząt, jest stosowanie w procesie wytwarzania szczepionek zasad Dobrej Praktyki Wytwarzania GMP (Good Manufacture Practice). Wymagania Farmakopei Europejskiej oraz zalecenia Europejskiej Agencji Leków EMA (EuropeanMedicalAgency) określają niezbędny zakres badań wykonywanych w ramach oceny jakości produktów leczniczych immunologicznych, w tym badań czynników zewnątrzpochodnych na wszystkich etapach wytwarzania, ze szczególnym naciskiem na etapy badania materiałów wyjściowych, linii komórek oraz serii siewnych (7, 14).
Zgodnie z aktualnymi wymaganiami, substraty pochodzenia zwierzęcego używane w procesie wy-twarzania szczepionek, takie jak np. linie komórek diploidalnych i ciągłych, muszą być wolne od zewną- trzpochodnych czynników zakaźnych. Badania obecności tych czynników powinny być wykonywane już na etapach procesu wytwarzania produktów pośrednich szczepionki, tj. serii siewnej wirusa i zbioru wirusa, oraz macierzystego lub roboczych banków komórek, włącznie z etapami badania komórek osiągających maksymalny lub wyższy poziom podwajania swojej liczby (15).

Badania prowadzone rutynowo obejmują wy-kluczenie obecności bakterii, grzybów, mykoplazm, spiroplazm (w liniach komórek owadów dodatkowo z użyciem mikroskopii elektronowej), badania czynników zewnątrzpochodnych w hodowlach komórek metodą współhodowli, z użyciem zwierząt, oraz swoiste badania możliwości zanieczyszczeń zależnych od pochodzenia komórek i badania w kierunku retrowirusów zdolnych do replikacji (7). Kurczęta, zarodki i hodowle komórek używane do produkcji lub kontroli jakości szczepionek muszą pochodzić z jaj od kur wolnych od określonych patogenów SPF (Specific Pathogen Free).
Dodatkowe zalecenia dotyczą konieczności wykonywania badań dla najczęściej stosowanych materiałów wyjściowych np. surowicy bydlęcej lub trypsyny (16). Z kolei w liniach komórek pochodzących od owadów powinny być wykonywane badania w kierunku obecności wirusów swoistych dla gatunku owada, z którego pochodzi linia komórek oraz w kierunku obecności arbowirusów (5).
Wymagania Europejskiej Agencji Leków w zakresie listy czynników zewnątrzpochodnych, których wykrywanie na aktualnym etapie wiedzy uznano za konieczne, są uzupełniane wraz z rozwojem technologii oraz odkrywaniem nowych wirusów (5). Obecnie konsultowana jest konieczność zalecenia badań obecności 69 wirusów bydlęcych (przedstawicieli 21 rodzin) i 52 wirusów świńskich (przedstawicieli 17 rodzin), w szczepionkach stosowanych u ludzi, ze względu na możliwość ich namnażania się w organizmie człowieka. W/w wirusy obecnie podlegają kontroli w procesie wytwarzania szczepionek weterynaryjnych (5).
Wraz z rozwojem wiedzy obowiązujące wytyczne dopuszczają wykorzystywanie w kontroli czynników zewnątrzpochodnych najnowszych technologii, przy czym oczekuje się międzynarodowej harmonizacji w zakresie ich stosowania (7).

METODY BADANIA OBECNOŚCI CZYNNIKÓW ZEWNĄTRZPOCHODNYCH

Obecnie stosowane metody wykrywania zanie-czyszczeń drobnoustrojami obejmują badanie za-nieczyszczeń bakteryjnych i grzybiczych, obecności mykoplazm oraz wirusów. W celu wykrycia wirusów wykonuje się oznaczenia zakaźności na zwierzętach lub zalężonych jajach kur (in vivo) oraz liniach komórek (in vitro) metodami biochemicznymi, PCR lub z użyciem transmisyjnej mikroskopii elektronowej TEM (Trans-mission Electron Microscopy). W celu ograniczania ryzyka przeniesienia TSE stosowane są dodatkowe strategie badań oraz oceny (7).
Nieswoiste badania in vivo z użyciem zwierząt, w zależności od rodzaju szczepionki, obejmują zakażanie zwierząt różnych gatunków, tj. myszy (w tym osesków), świnek, królików lub zalężonych jaj kur. Po zakażeniu zwierzęta poddawane są obserwacji pod kątem wystąpienia objawów zakażeń wirusowych, a w przypadku stwierdzenia ich obecności zapoczątkowują dalsze badania mające na celu swoistą identyfikację czynnika wywołującego chorobę (2, 3, 7).
Badania in vivo obejmują również wykrywanie obecności przeciwciał w surowicach uzyskanych od zakażanych lub immunizowanych zwierząt (np. przez podanie lizatów komórek linii czy nadsączy hodowli komórek po zneutralizowaniu wirusa szczepionkowego) prowadzone z użyciem zwierząt SPF, najczęściej gryzoni, lub kurcząt. Możliwe są również badania obecności
wirusów hemaglutynujących po zneutralizowaniu wirusa szczepionkowego w jamie omoczni w zalężonych jajach kur SPF (14, 15).
Wirusy można wykrywać stosując nieswoiste badania in vitro z użyciem linii komórek, dzięki którym można identyfikować wirusy wywołujące efekt cytopatyczny oraz wirusy hemadsorbujące i hemaglutynujące. Wybór linii komórek do badań nad wykrywaniem czynników zewnątrzpochodnych zależy od czynników, których możemy się potencjalnie spodziewać w linii komórek, a to z kolei jest uzależnione od gatunku jej dawcy. W tym wypadku można użyć jedynie linii komórek permisywnych, ale wiele wirusów w tych liniach nie replikuje się (7, 9).
Metody in vivo pozwalają na wykrywanie efektu cytopatycznego, hemaglutynacji lub hemadsorpcji dla szerokiego zakresu wirusów patogennych dla człowieka lub dla gatunku docelowego zwierząt. Oznaczanie zakaźności w badaniach na myszach pozwala wykryć obecność m.in: wirusów coxackie A i B, pikornawiru- sów (poliowirusy i echowirusy), alfawirusów, bunyawi- rusów (phlebowirusy, nairowirusy), arenawirusów, fla- viwirusów, wirusa wścieklizny, herpeswirusów, wirusa limfatycznego zapalenia opon i splotów naczyniowych lub wirusów mysich. Badania zakaźności w zalężonych jajach kur, po neutralizacji wirusa szczepionkowego, pozwalają wykryć efekt hemaglutynacji, który może być wywołany przez: ortomyksowirusy, paramyksowirusy, alfawirusy, wesiculowirusy, herpeswirusy, poxwirusy, rhabdowirusy (3).
Słabym punktem metod in vivo wykrywania czyn-ników zewnątrzpochodnych jest ich niedostateczna czułość. Trudności tych badań wynikają z faktu, że wiele wirusów patogennych dla człowieka nie zakaża i nie replikuje się w organizmach gryzoni ani w jajach kur. Stosowanie inwazyjnych procedur badań u zwierząt (np. domózgowe zakażanie myszy), trwających często stosunkowo długi okres czasu (od 14 dni do 4 tygodni) powinno być zgodnie z wytycznymi „Europejskiej konwencji o ochronie kręgowców używanych do badań doświadczalnych i innych celów naukowych” ograniczane przez zastosowanie alternatywnych, metod in vitro (3, 7, 14).
Metoda transmisyjnej mikroskopii elektronowej stosowana np. do badań linii komórek owadów, pozwala wykrywać cząstki wirusów, w tym endogenne retrowirusy, z czułością ok. 106 cząstek wirusów/ml, jednocześnie umożliwiając różnicowanie endogennych i latentnych retrowirusów (17).
Aktualne wymagania, poza wymienionymi metodami, umożliwiają stosowanie przez wytwórcę czy też instytucję do tego celu upoważnioną metod alternatywnych pod warunkiem, że wykazana zostanie ich zgodność z metodami konwencjonalnymi w zakresie osiąganej czułości i swoistości (9). Od końca lat 90-tych podejmowane są starania aby zastępować dotychczasowe metody konwencjonalne nowymi, w tym głównie PCR i od niedawna PCR w czasie rzeczywistym. Warunkiem stosowania tych metod jest uzyskanie zgody ze strony instytucji do tego celu upoważnionej (9, 14, 18). Metody alternatywne nie wymagają użycia zwierząt ani linii komórek, i jeżeli są odpowiednio zwalidowane: są szybsze i czulsze w porównaniu do metod konwencjonalnych. Walidację metod i precyzyjne określenie powtarzalności zapewnia użycie referencyjnych materiałów odniesienia o znanej najmniejszej zawartości kwasu nukleinowego. Ze względu na fakt, że w zaleceniach Farmakopei Europejskiej nie zaleca się stosowania konkretnych starterów, metoda PCR w zależności od ich wyboru, może charakteryzować się różną czułością oraz swoistością wykrywania czynników zewnątrzpochodnych (7, 14). Metoda PCR została skutecznie zaadoptowana i jest aktualnie wykorzystywana przez wytwórców i instytucje do tego celu upoważnione do wykrywania m.in. wirusa choroby Newcastle NDV (Newcastle Disease Virus), wirusa ARV (AIDS Related Virus), wirusa grypy ptaków AIV (Avian Influenza Virus), wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli kur IBV (Avian Infectious Bronchitis Virus) (9). Do pośrednich analiz umożliwiających wykazanie braku czynników zanieczyszczających stosowana jest również analiza kwasu nukleinowego linii komórek metodą fingerprint (7).
Z kolei obecność retrowirusów badana jest metodą oznaczania aktywności odwrotnej transkryptazy PERT (Product-Enhanced Reverse Transcriptase Assay) (7). Najnowszą odmianą badania w kierunku retrowirusów jest ilościowe oznaczanie testem PERT stosowane do potwierdzania ekspresji niezakaźnych cząstek endogennego retrowirusa w różnych substratach komórek np. w zalężonych jajach, linii komórek CHO (17).

NOWE METODY BADANIA POTENCJALNYCH CZYNNIKÓW ZEWNĄTRZPOCHODNYCH

Szansą poprawy bezpieczeństwa produkowanych szczepionek jest opracowanie nowych układów identy-fikacji wirusów, dla których nie są dostępne komercyjne lub konwencjonalne systemy wykrywania. Dotyczy to głównie opracowania i walidacji metod wykrywania kwasów nukleinowych opartych na amplifikacji do wykrywania wirusów RNA i DNA. Zastosowanie takich badań jest uzależnione od dostępności danych umożliwiających wykonanie analiz homologii sekwencji w dostępnych bazach danych pozwalających na wybór swoistych starterów, ponadto od optymalizacji samej reakcji PCR i potwierdzenia swoistości i czułości metody np. metodą hybrydyzacji (na matrycy DNA/
RNA szczepów szczepionkowych, dzikich szczepów wirusa, pokrewnych wirusów) oraz od potwierdzenia identyfikacji metodą sekwencjonowania (9, 18, 19).
Innego podejścia wymagają badania możliwych zanieczyszczeń przy zastosowaniu technik amplifikacji kwasów nukleinowych NAT (Nucleic Acid Amplification Techniques) z lub bez wcześniejszego namnażania czynników zanieczyszczających w liniach komórek. Badania tej grupy są przeznaczone zwłaszcza do wy-krywania tych zanieczyszczeń, o których wiadomo, że powodują latentne zakażenia gatunków, od których po-chodzi hodowla np. małpi wirus SV40 lub wirus Flock house w komórkach owadów. W tym wypadku techniki NAT mogą być wymiennie stosowane z technikami immunoenzymatycznymi, metodą seroneutralizacji czy badaniami wytwarzania swoistych przeciwciał u wraż-liwych zwierząt (7).
Wielkie nadzieje optymalizacji badań nad czynnikami zewnątrzpochodnymi zanieczyszczającymi szczepionki związane są z możliwościami identyfikacji całego metagenomu składowych szczepionki przez identyfikację całego materiału genetycznego zawartego w próbce, w tym potencjalnych czynników zakaźnych. Instytucje do tego celu upoważnione, takie jak Europej – ska Agencja Leków ocenia przydatność nowych metod takich jak: równoległe sekwencjonowanie wielu fragmentów DNA (Massively Paralel Sequencing), badania na mikronośnikach DNA, PCR w czasie rzeczywistym oraz spektrometria masowa. Uzupełnienie dotychczas zalecanych metod zapewne zaowocuje nowymi ustaleniami regulacyjnymi (14, 18, 19).
Zastosowanie analiz metagenomu oraz transkryptomu szczepionek wirusowych, w tym analiz na mikro- nośnikach DNA, pirosekwencjonowania oraz spektrometrii masowej pozwoliły zidentyfikować sekwencje wirusa nie będące sekwencjami wirusa szczepionkowego. Matrycą do badań był przesącz szczepionki, trawiony nukleazą, poddany amplifikacji, a następnie analizie podobieństwa sekwencji wirusowych (18, 20). W taki sposób wykryto m.in. endogenne sekwencje retrowirusów czy wirusa białaczki ptasiej w substratach zalężonych jaj kur. Z kolei badania transkryptomu w nadsączach substratów komórek lub szczepionkowych seriach siewnych wirusów pozwoliły na wykrycie nieznanych wcześniej parwowirusów bydlęcych 2 i 3 oraz bydlęcego wirusa 2 związanego z adenowirusem (Bovine Adeno Associated Virus 2). Wskazano, że źródłem zanieczyszczenia tymi wirusami była stosowana w procesie wytwarzania szczepionki surowica bydlęca (19). Wykrywanie aktywności odwrotnej transkryp- tazy RT metodą PERT w szczepionce przeciw odrze pozwoliło na identyfikację endogennego retrowirusa ptaków, którego obecność łączono ze stosowaniem do namnażania wirusa odry, zalężonych jaj kur. Wykrycie tego wirusa, podobnie jak wykrycie obecności endogennego retrowirusa kotów RD-114 w szczepionkach weterynaryjnych, zostało wszechstronnie przeanalizowane i instytucje do tego upoważnione zdecydowały o utrzymaniu tych szczepionek na rynku (17, 21).
Zastosowanie najnowszej generacji sekwencjono- wania tzw. metody pirosekwencjonowania pozwoliło wykryć fragmenty sekwencji cirkowirusa PCV1 (Porcine Circovirus) w żywej atenuowanej szczepionce przeciw rotawirusom Rotarix (20). Badania wykonane w 2010 r. przez wytwórcę tej szczepionki potwierdziły obecność wirusów PCV 1 i PCV2 w macierzystych bankach komórek linii Vero i seriach siewnych rotawi- rusa. Identyfikację fragmentów materiału genetycznego wirusa PCV 1 i PCV 2 wykonaną metodą PCR potwierdzono metodą sekwencjonowania (20, 22). Wstępne doniesienia dotyczące wykrycia DNA wirusa PCV1 na poziomie >105 w dwóch seriach szczepionki, były związane ze stwierdzeniem pozostałości DNA wirusa spowodowanych niedostateczną inaktywacją trypsyny (20). Kolejne badania potwierdziły obecność genomu wirusa PCV1, cząstek wirusa w badanych próbkach oraz ich zakaźność w liniach nerki świni (PK-15), HEK 293 oraz Vero (23). Badania większej liczby próbek serii szczepionek przeciw rotawirusom dostępnych na rynku potwierdziły obecność cząstek wirusa PCV1 w szczepionce Rotarix w liczbie 105-106 cząstek oraz 6-7log10 kopii DNA/dawkę szczepionki, czyli nawet wyższym niż to wykazane w badaniach Victoria i wsp. oraz McLenahan i wsp. (20, 23). Najbardziej prawdopodobnym źródłem zakażenia była trypsyna pochodzenia świńskiego używana jako dodatek do podłoży hodowlanych przy pasażowaniu linii komórek Vero. Podobne zanieczyszczenia pochodzące z linii komórek Vero wykryto w seriach szczepionki przeciw poliomyelitis tego samego wytwórcy. Z kolei fragmenty DNA wirusa PCV1 wykryto również w szczepionce Rotateq (23). Cirkowirus PCV1 jest nieosłonkowym wirusem DNA, i podobnie jak wirus PCV 2 wywołuje zakażenia u świń. Oba wirusy są przenoszone między osobnikami świń drogą pokarmową. Dotychczas nie potwierdzono ich zdolności do replikacji w organizmie człowieka, nie wykazano efektu cytopatycznego w linii komórek Vero, czy też komórkach ludzkich, a także serokonwersji u lekarzy weterynarii lub hodowców zwierząt (22, 24).
Szczepionki przeciw rotawirusom są od kilku lat z powodzeniem stosowane w profilaktyce biegunek rotawirusowych u noworodków i niemowląt. Bezpie-czeństwo tych szczepionek potwierdzono w badaniach klinicznych i w trakcie ich oceny porejestracyjnej obejmującej ocenę niepożądanych odczynów poszcze- piennych (NOP). Wykrycie sekwencji DNA wirusów PCV1 oraz PCV2 w tych szczepionkach wzbudziło niepokój i spowodowało podjęcie badań mających na celu potwierdzenie czy tego rodzaju zanieczyszczenie może występować w innych szczepionkach. Dotychczasowe wyniki wykazują brak dowodów na to, że obecność DNA wirusów PCV lub ich cząstek wpływa na zdrowie osób zaszczepionych. Na nadzwyczajnych posiedzeniach Europejskiej Agencji Leków oraz Ame-rykańskiego Urzędu ds. Żywności i Leków FDA (Food and Drug Administration) w maju 2010 r. w wyniku szczegółowego dochodzenia uznano, że obecność nie- chorobotwórczego cirkowirusa świń PCV 1 w seriach produkcyjnych szczepionki Rotarix oraz fragmentów DNA tego wirusa w szczepionce Rotateq nie stanowi zagrożenia dla zaszczepionych dzieci. Zobowiązano jednak wytwórców do wprowadzenia dodatkowych środków zaradczych, które zapewnią ochronę przed zanieczyszczeniem tymi wirusami kolejnych serii wy-twarzanych szczepionek (25).
Wykrycie sekwencji i cząstek zakaźnego wirusa PCV1 oraz sekwencji wirusa PCV2 było przyczyną podjęcia szerokiej dyskusji nad koniecznością ponownego uaktualnienia listy wirusów, które powinny być badane jako czynniki zewnątrzpochodne w procesie wytwarzania szczepionek, w związku z tym można oczekiwać, że zostanie wprowadzone do zakresu badań kontrolnych w banku komórek oznaczanie nieosłonkowych wirusów ssRNA (Enterovirusów, wirusów encefalomyocarditis, nieosłonkowych wirusów ssDNA (TTV- Torque Teno virus), Hokowirusa, parwowirusa bydlęcego (Bocavi- rus) oraz metody pirosekwencjonowania do kontroli materiałów wyjściowych szczepionek (3).

PODSUMOWANIE I WNIOSKI

Obecne wymagania i zalecenia dotyczące oceny bezpieczeństwa szczepionek w aspekcie kontroli obecności czynników zewnątrzpochodnych nie eliminują całkowicie ryzyka ich zanieczyszczeń. Wykrywane w ostatnich latach przypadki zanieczyszczeń czynnikami zewnątrzpochodnymi serii szczepionek stosowanych u ludzi i zwierząt przyczyniły się do uaktywnienia działań instytucji do tego celu upoważnionych oraz wytwórców w celu wprowadzenia dodatkowych środków bezpieczeństwa szczepionek wirusowych, np. poprzez wykrywanie sekwencji lub zakaźnych cząstek obcych wirusów. Działalność ta wiąże się z określeniem poszerzonego zakresu badań kontroli czynników zewnątrzpo- chodnych z uwzględnieniem badań m.in. metagenomu szczepionek, walidacji nowo wprowadzanych metod kontrolnych oraz rozszerzania panelu wykrywanych czynników wirusowych. W celu poprawy poziomu oceny zanieczyszczeń czynnikami zewnątrzpochodnymi konieczna jest bieżąca aktualizacja wytycznych zgodna z aktualnym stanem wiedzy.

PIŚMIENICTWO:

1. Janaszek-Seydlitz W. Bepieczeństwo szczepionek w Wakcynologia Red. W. Magdzik, D. Naruszewicz-Le- siuk, A. Zieliński. Bielsko-Biała: a-medicapress 2007, 110-5.
2. Pastoret P-P. Human and animal vaccine contaminations. Biologicals 2010; 38: 332-4.
3. Sheets R, Loewer J, Raychaudhuri G, i in. Adventitious agents, new technology, and risk assessment, 19-20 May 2011, Baltimore, MD. Biologicals 2012; 40: 162-7.
4. Bruckner L. Viral safety and extraneous agents testing for veterinary vaccines: Rationale for requirements, the European approach. Biologicals 2010; 38:338-9.
5. Marcus-Sekura C, Richardson JC, Harston RK, i in. Eva¬luation of the human host range of bovine and porcine viruses that may contaminate bovine serum and porcine trypsin used in the manufacture of biological products. Biologicals 2011; 39: 359-69.
6. European Pharmacopoeia. Chicken flocks free from spe¬cified pathogens for the production and quality control of vaccines, method 5.2.2. 7th ed. Strasbourg: Counsil of Europe. 2011; 645-8.
7. European Pharmacopoeia. Cell substartes for the pro¬duction of vaccines for human use, method 5.2.3. 7th ed. Strasbourg: Counsil of Europe; 2011; 648-51.
8. International Taxonomy of Viruses (ICTV). http://www.ictvonline.org/virusTaxInfo.asp;2009.
9. Motitschke A, Ottinger HP, Jungback C. Evaluation of the sensitivity of PCR methods for the detection of extraneous agents and comparison with in vivo testing. Biologicals 2010; 38: 389-92.
10. Kappeler A, Lutz-Wallace C, Saoo T, i in. Detection of bovine polyomavirus contamination in fetal bovine sera and modified live viral vaccines using polymerase chain reaction. Biologicals 1996; 24: 131-5.
11. Krakowska S, Ringler SS, Arumugam P, i in. Evaluation of Mycoplasma hypopneumoniae bacterins for porcine Torque Teno virus DNAs. Am J Vet Res 2008; 69: 1601¬741.
12. Cutrone R, Ladnicky J, Dunn G, i in. Some oral poliovirus vaccines were contaminated with infectious SV40 after 1961. Cancer Res 2005; 65: 10273-9.
13. Kew OM, Sutter RW, de Gourville EM, i in. Vaccine- derived polioviruses and the endgame strategy for global polio eradication. Annu Rev Microbiol 2005; 59: 587-635.
14. Hess RD, Weber F, Watson K, i in. Regulatory, biosafety and safety challenges for novel cells as substrates for human vaccines. Vaccine 2012; 30: 2715-27.
15. European Pharmacopoeia. Tests for extraneous agents in viral vaccines for human use, method 2.6.16. 7th ed. Strasbourg: Counsil of Europe; 2011; 266-7.
16. Concept paper for a guideline on the quality of porcine trypsin used in the manufacture of human biological products. EMA/CHMP/BWP/367751/2011.
17. Miyazawa T. Endogenous retroviruses as potential ha¬zards for vaccines. Biologicals 2010; 38: 371-6.
18. Onions D, Cote C, Love B, i in. Ensuring the safety of vaccine cell substrates by massively parallel sequencing of the transcriptome. Vaccine 2011; 29: 7117-21.
19. Onions D, Kolman J. Massively parallel sequencing, a new method for detecting adventitious agents. Biologi- cals 2010; 38: 377-80.
20. Victoria JG, Wang Ch, Jones M S, Jaing C, McLoughlin K, Gardner S, Delwart EL. Viral nucleic acids in live¬-attenuated vaccines: detection of minority variants and an adventitious virus. J Virol 2010; 84: 6033-40.
21. Feline endogenous retrovirus RD114 in some live atte¬nuated vaccines commercially available in the EU for use in animals. CVMP assessment report. Procedure no: EMEA/V/A/058. September 2010.
22. Baylis S A, Finsterbusch T, Banner N, i in. Analysis of porcine circovirus type 1 detected in Rotarix vaccine. Vaccine 2011; 29: 690-97.
23. McClenahan SD, Krause PR, Uhlenhaut Ch. Molecular and infectivity studies of porcine circovirus in vaccines. Vaccine 2011; 29: 4745-53.
24. Li L, Kapoor A, Slikas O, i in. Multiple diverse circo- viruses infect farm animals and are commonly found in human and chimpanzee faces. J Virol 2010; 84: 1674-82.
25. Questions and answers on the review of Rotarix (ro- tavirus vaccine, live). Outcome of a procedure under Article 20 of Regulation (EC) No 726/2004. EMA/ CVMP/460465/2010.
Otrzymano: 16.04.2012 r.
Zaakceptowano do druku: 29.08.2012 r.

Adres do korespondencji:
Dr hab. Ewa Augustynowicz
Zakład Badania Surowic i Szczepionek
Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego-Państwowy

Zakład Higieny
ul. Chocimska 24, 00-791 Warszawa
Tel. 22 54 21 213, e-mail: ea************@pz*.pl