Dyskusja na Temat Tuberkulin w Medycynie Ludzkiej i Weterynaryjnej – Dr H. H. Green

Dyskusja na Temat Tuberkulin w Medycynie Ludzkiej i Weterynaryjnej – Dr H. H. Green

Dr H. H. Green, Laboratorium Weterynaryjne, Ministerstwo Rolnictwa, Weybridge

Celem niniejszego artykułu wprowadzającego jest krótkie omówienie typów tuberkuliny stosowanych w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej, ze szczególnym uwzględnieniem opisu tuberkulin ssaczych w British Pharmacopoeia oraz Pharmaceutical Codex, a także właściwości swoistości różnych tuberkulin oraz kryteriów swoistości wymaganych w sytuacji, gdy człowiek nie jest jedynym rozpatrywanym organizmem. Źródłem mojego wkładu jest dyskusja z profesorem R. E. Gloverem dotycząca sformułowania opisu tuberkulin przeznaczonych do przyszłego Weterynaryjnego Kodeksu Farmaceutycznego, w której podkreślałem, że weterynarz powinien pozostawać w możliwie największym stopniu niezależny od tradycji medycznej i w żaden sposób nie powinien być związany Kodeksem B.P.

Artykuł ten wiąże się również z korespondencją z dr. A. A. Milesem dotyczącą problemów standaryzacji biologicznej, a także z dyskusją w Ministerstwie Zdrowia, w której postulowałem powszechne wprowadzenie tuberkuliny w postaci Oczyszczonej Pochodnej Białkowej (O.P.B.). zamiast Starej Tuberkuliny. Niniejsze wprowadzenie przedstawia perspektywę biochemika i uzasadnia stosowanie tuberkuliny w postaci Oczyszczonej Pochodnej Białkowej (O.P.B.).

TYPY TUBERKULINY

 

W British Pharmacopoeia oraz Pharmaceutical Codex wyróżnia się dwa typy tuberkuliny:

Stara tuberkulina (Old Tuberculin – O.T.) oraz „Oczyszczona Pochodna Białkowa (Purified Protein Derivative Tuberculin – P.P.D.), jednak przynajmniej moim zdaniem, specyfikacje dotyczące obu pozostawiają wiele do życzenia. Wielu lekarzy, z którymi rozmawiałem, nawet specjalistów zajmujących się gruźlicą, wykazuje niejasność co do chemicznej natury tych preparatów oraz ich względnych zalet.

(1) Stara Tuberkulina (Old Tuberculin – O.T.)

W opisie przygotowania Starej Tuberkuliny dopuszcza się szeroką dowolność w wyborze pożywek do hodowli, a także nie wymaga się zastosowania konkretnego szczepu Mycobacterium tuberculosis. Zakłada się, że ten sam produkt końcowy zostanie uzyskany niezależnie od tego, czy końcowy płyn zostanie odparowany w obecności mikroorganizmów, czy po ich usunięciu przez filtrację. Stwierdza się również, że brak jest jednoznacznych dowodów na to, iż preparaty uzyskane z typu ludzkiego i typu bydlęcego „różnią się pod względem zasady czynnej”.

Specyfikacja, zgodnie z którą pożywka powinna zawierać 5% glicerolu, a po hodowli powinna zostać odparowana do jednej dziesiątej objętości w łaźni wodnej, sugeruje, że tuberkulina skoncentrowana cieplnie, odbiegająca od tego sposobu wytwarzania, nie powinna być określana jako Stara Tuberkulina i nie mogłaby być jako taka wydawana. Sformułowanie „w razie potrzeby rozcieńczona 50% glicerolem” pomija fakt, że jeśli rozcieńczenie nie jest konieczne, produkt końcowy może zawierać bardzo niewielkie ilości glicerolu. Rzeczywiście, jeden z preparatów o jakości poniżej standardu, dostarczony przez znany instytut, mimo że odpowiadał międzynarodowemu standardowi pod względem aktywności, wykazał jedynie 2% glicerolu przy analizie z użyciem specyficznej techniki nadjodanowej.

Jedyną kwestią, która wydaje się mieć znaczenie w opisie zawartym w British Pharmacopoeia, jest to, że końcowy preparat musi odpowiadać międzynarodowemu standardowi Starej Tuberkuliny pod względem mocy, jednak nawet w tym przypadku nie narzuca się żadnej precyzyjnej metody oznaczania aktywności.

Z pewnością uprościłoby to życie producentom, gdyby Stara Tuberkulina została jasno opisana jako:

„dowolna mikstura czarownic powstała przez odparowanie dowolnego, nieokreślonego płynu hodowlanego, w którym wyhodowano dowolny, nieokreślony szczep ssaczego Mycobacterium tuberculosis, pod warunkiem że jego moc odpowiada mocy innej mikstury czarownic przechowywanej w Kopenhadze i nazywanej standardem międzynarodowym lub jakiegokolwiek rzekomo równoważnego pod standardu, przy badaniu na nieokreślonej liczbie świnek morskich, bez nadmiernego przejmowania się analizą statystyczną wyników.”

Jeśli zostanę o to poproszony, mogę obronić tę dość śmiałą propozycję zmiany British Pharmacopoeia na podstawie analiz chemicznych oraz testów aktywności przeprowadzonych na różnych rzeczywistych próbkach zakupionych na wolnym rynku jako „Stara Tuberkulina [Old Tuberculin]”.

Ich aktywność wahała się od połowy do trzykrotności standardu międzynarodowego, przy czym preparat o najwyższej aktywności, produkt amerykański, również sprzedawany w tym kraju, wydaje się, na podstawie swoich właściwości fizykochemicznych, być skoncentrowany inną metodą niż proste odparowanie cieplne.

Jedna z próbek określonych jako „tuberkulina”, nieopisana jako Stara Tuberkulina i bez deklaracji zgodności ze standardem B.P., wykazała aktywność wynoszącą zaledwie około jedną dziesiątą standardu międzynarodowego, co stanowi wyraźny dowód, że przed jej wprowadzeniem do obrotu nie przeprowadzono wiarygodnego testu na świnkach morskich.

Należy oczywiście zaznaczyć, że British Pharmacopoeia (1948, s. 803) sugeruje technikę standaryzacji oraz podaje granice ufności dla prawidłowo przeprowadzonego, losowego testu na ośmiu świnkach morskich, jednak nie ma obowiązku stosowania się do tej sugestii, a jest niemal pewne, że niektóre komercyjne standaryzacje, w różnych krajach, są przeprowadzane w sposób bardzo niedbały.

W literaturze dotyczącej gruźlicy panuje również znaczne zamieszanie odnośnie rzeczywistej aktywności różnych skoncentrowanych tuberkulin. Przykładowo spotkałem się z określeniem „tuberkulina otrzymywana z syntetycznego podłoża, zagęszczona termicznie [heat concentrated synthetic medium tuberculin – H.C.S.M.” Biura Przemysłu Zwierzęcego (Bureau of Animal Industry

– B.A.I.) w Stanach Zjednoczonych jako „jedna czwarta Starej Tuberkuliny”. W rzeczywistości preparat ten odpowiada standardowi międzynarodowemu pod względem aktywności, a nawet zwykle nieco go przewyższa. Nieporozumienie wynika z założenia, że jeśli filtrat hodowli bakteryjnej zostanie odparowany do jednej dziesiątej objętości, to jego aktywność zwiększa się dziesięciokrotnie. A ponieważ tuberkulina Biura Przemysłu Zwierzęcego [B.A.I.] powstaje przez odparowanie do jednej piątej objętości, a następnie rozcieńczenie równą objętością fenolizowanego glicerolu, przyjmuje się, że może mieć jedynie jedną czwartą aktywności.

Wiele osób zajmujących się produkcją tuberkuliny, lecz niebędących chemikami, zapomina lub nie zdaje sobie sprawy, że proces odparowywania filtratu hodowlanego w naczyniach na łaźni parowej prowadzi do znacznej denaturacji aktywnego składnika białkowego. Ponadto podczas usuwania nierozpuszczalnych osadów w końcowym etapie klarowania może zostać odrzucone nawet dwie trzecie pierwotnie obecnego materiału aktywnego. Dodatkowo proces odparowywania może powodować znaczne utlenianie glicerolu oraz powstawanie z niego kwasów. W efekcie odparowanie do jednej dziesiątej objętości może zwiększyć pierwotną aktywność jedynie dwu- lub trzykrotnie, dlatego należy uznać tę metodę za marnotrawną, niestabilną i przestarzałą. Proces ten oczywiście powoduje dziesięciokrotne stężenie niewykorzystanych soli pierwotnej pożywki oraz części niepożądanych produktów ubocznych wzrostu bakterii, co może prowadzić do powstania końcowej „mikstury czarownic”, z której podczas przechowywania może krystalizować fosforan amonowo-magnezowy, wymagając ponownego klarowania.

Nie uważam, aby w tej mieszaninie znajdowało się coś, co można by uznać za pożądane, poza pozostałością tuberkuloproteiny. Jeśli celem odparowywania jest jedynie zagęszczenie składnika aktywnego, znacznie prostszą i czystszą metodą jest przepuszczenie filtratu bakteryjnego przez błonę kolodionową, pozostawiając około jednej czwartej objętości, następnie oznaczenie jego aktywności i rozcieńczenie do poziomu standardu międzynarodowego. Jeszcze prostsze jest zastosowanie odpowiedniej pożywki syntetycznej, oznaczenie tuberkuloproteiny w filtracie metodami analizy chemicznej oraz ultrafiltracja do pożądanej końcowej koncentracji. W takim przypadku późniejszy test biologiczny staje się jedynie „formalnością”, pod warunkiem że użyty szczep drobnoustroju jest ustalony („fixed”) i produkuje tuberkuloproteinę o znanych właściwościach.

Nie zawsze również zdaje się sprawę z tego, że ilość składnika aktywnego, poza jego specyficznymi właściwościami biologicznymi, w dużym stopniu zależy od zastosowanego szczepu drobnoustroju, rodzaju pożywki oraz precyzji w ustaleniu początkowego pH. Przy zastosowaniu pożywki B.A.I. zawierającej 10% glicerolu i 1,4% asparaginy, z użyciem szczepów B.A.I. D.T., P.N. i C., oraz przy początkowym pH 6,8, można bez trudu uzyskać po ośmiu tygodniach hodowli filtrat bakteryjny zawierający 0,7–1,2 grama składnika aktywnego na litr, co odpowiada około połowie aktywności standardu międzynarodowego bez dodatkowego zagęszczania. Natomiast przy zastosowaniu pożywki syntetycznej zawierającej jedynie 5% glicerolu, mniejszą ilość substratu azotowego oraz mniej starannie dobranych szczepów, równie łatwo można uzyskać mniej niż jedną trzecią tej ilości składnika aktywnego. Dodając do tego nieprzewidywalne zagrożenia związane z odparowywaniem do jednej dziesiątej objętości w łaźni parowej przy przepływie ciepłego powietrza, nie dziwi fakt, że British Pharmacopoeia stwierdza, iż: „jeśli aktywność koncentratu jest niższa niż preparatu standardowego, zostaje on odrzucony.”

Wszystkich tych trudności można by uniknąć, gdyby określono stosowany szczep oraz pożywkę, a także zastosowano bardziej odpowiednie metody zagęszczania. O ile mi wiadomo, nikt nie proponował prostego zastosowania ultrafiltracji jako metody koncentracji, a pojawienie się tuberkulin P.P.D. w praktyce przekreśla taką propozycję już na wstępie, chyba że dla producenta, który chciałby wytwarzać pozorne preparaty Starej Tuberkuliny, albo dla badacza zainteresowanego analizą możliwych biologicznych efektów ultrafiltrujących się produktów ubocznych wzrostu bakterii.

Osobiście nie widzę żadnego sensu w dalszym stosowaniu przez środowisko medyczne tuberkulin zagęszczanych cieplnie. Tuberkuliny w postaci „Oczyszczonej Pochodnej Białkowej” (O.P.B.) są czystsze, znacznie tańsze w produkcji (w przeliczeniu na jednostkę tuberkulinową) oraz znacznie łatwiejsze do standaryzacji z wysokim stopniem precyzji. Pod warunkiem braku zmienności stosowanego szczepu drobnoustroju, mogą być wytwarzane na podstawie dokładnej analizy chemicznej lub według schematu „masa–objętość” przy dowolnie ustalonej aktywności. W takim przypadku sporadyczne testy biologiczne są potrzebne jedynie w celu wykrycia ewentualnych, nieoczekiwanych zmian właściwości laboratoryjnych szczepów Mycobacterium tuberculosis (co jest bardzo mało prawdopodobne, jeśli są one „ustalone”), zarówno pod względem aktywności, jak i swoistości wytwarzanej pochodnej białkowej.

(2) Tuberkuliny w postaci Oczyszczonej Pochodnej Białkowej (O.P.B.)

W części opisowej British Pharmacopoeia i Pharmaceutical Codex, odnoszącej się wyłącznie do odmiany hominis, nie podejmuje się próby wyjaśnienia, czym w istocie jest „Oczyszczona Pochodna Białkowa [Purified Protein Derivative – PPD]”, poza stwierdzeniem, że jest to „zasada czynna starej tuberkuliny”. Można jedynie mieć nadzieję, że jest to powszechnie uznawane za prawdę, ponieważ w takim przypadku argument za dalszym stosowaniem „Starej Tuberkuliny” przez środowisko medyczne w tym kraju zostaje obalony jednym ruchem. Pomija się jednak fakt, że słowo „oczyszczony” nie jest tożsame ze słowem „czysty” oraz że nawet najlepsze dostępne na rynku preparaty w postaci Oczyszczonej Pochodnej Białkowej, zawierające około 90% tuberkuloproteiny, nadal zawierają istotne ilości polisacharydów i kwasów nukleinowych, które jak wiadomo nie mają znaczenia w reakcji śródskórnej na tuberkulinę. Składniki te można usunąć, uzyskując produkt zawierający około 99% tuberkuloproteiny, jednak dodatkowa, złożona procedura nie jest uzasadniona ekonomicznie, dopóki obecność tych zanieczyszczeń nie jest uznawana za istotną.

Nie mają one znaczenia w teście śródskórnym, chociaż polisacharydy mogą mieć znaczenie w przypadku wykorzystania tuberkuliny jako antygenu w teście hemaglutynacyjnym. Sposób przygotowania określany jest jako „złożony proces”, chociaż niemal cała światowa produkcja od 1943 roku odbywa się przy użyciu wyjątkowo prostych i tanich metod.  Stwierdzenie, że „po rozpuszczeniu 5 mg suchego proszku w 1 ml odpowiedniego buforu aktywność roztworu jest równoważna aktywności standardowego preparatu starej tuberkuliny”, jest bardzo mylące, jeśli nie zaznacza się, że taki preparat nadal zawiera około dwóch trzecich materiału obojętnego. Należałoby zaznaczyć, że najprostsza i najtańsza metoda wytwarzania (tzw. technika Weybridge) daje produkt (o czystości około 90%), w którym stężenie 2 mg/ml odpowiada standardowi międzynarodowemu, a także że zapasowy standard dla Oczyszczonej Pochodnej Białkowej przygotowany przez Seibert w Stanach Zjednoczonych (przy użyciu niepotrzebnie skomplikowanej metody) dla Światowej Organizacji Zdrowia, choć najwyraźniej nigdy przez nią nieużyty, wykazywał tę samą aktywność.

Z jej preparatu, wytwarzanego w małych ilościach jako materiał odniesienia, oraz z naszego, produkowanego corocznie w ogromnych ilościach od 1943 roku, wynika, że jedna „jednostka tuberkulinowa” odpowiada 0,00002 mg Oczyszczonej Pochodnej Białkowej. Niski standard przyjęty w British Pharmacopoeia (0,00005 mg na jednostkę) doprowadził do pewnego zamieszania w literaturze, a produkty zgodne z tym standardem trudno w ogóle uznać za „oczyszczone”.

 

Czym zatem jest Oczyszczona Pochodna Białkowa?

 

Określenie to zostało wprowadzone przez Seibert pod koniec lat trzydziestych w odniesieniu do odmiany hominis jako oczyszczonej tuberkuloproteiny lub mieszaniny tuberkuloprotein o podobnym charakterze, które następnie szczegółowo scharakteryzowała. Ja sam, kilka lat później, rozszerzyłem znaczenie tego pojęcia na inne bakterie kwasooporne, definiując Oczyszczoną Pochodną Białkową jako: „rozpuszczalne w wodzie, niekoagulujące pod wpływem ciepła, niskocząsteczkowe frakcje białkowe obecne w parowanym filtracie hodowlanym, po wzroście Mycobacterium tuberculosis lub pokrewnych organizmów kwasoopornych w pożywce syntetycznej, w przybliżeniu oczyszczone po wytrąceniu za pomocą dowolnego środka wytrącającego białka, który można następnie łatwo usunąć” oraz zwróciłem uwagę na właściwości swoistości pochodnych białkowych sześciu różnych bakterii kwasoopornych, w tym M. tuberculosis (odmiany hominis, bovis, BCG oraz avium).

Technika produkcji tuberkuliny „Oczyszczonej Pochodnej Białkowej Weybridge”.

Metoda wytwarzania tuberkulin typu „Oczyszczona Pochodna Białkowa Weybridge”, opracowana w 1939 roku i stosowana rutynowo od 1943 roku, została opublikowana w The Veterinary Journal we wrześniu 1946 roku. Proces ten obejmuje: hodowlę ustalonych szczepów laboratoryjnych w pożywce syntetycznej przez osiem tygodni w jednostkach litrowych, poddanie hodowli działaniu pary w celu zabicia drobnoustrojów, filtrację przez pulpy papierowe, bezpośrednie wytrącenie całkowitego białka z klarownego filtratu za pomocą kwasu trichlorooctowego (co pozwala uniknąć denaturacji i dużych strat związanych z wcześniejszym zagęszczaniem cieplnym), odwirowywanie i płukanie osadu buforowaną wodą w celu usunięcia kwasu trichlorooctowego, ponowne rozpuszczenie wilgotnego osadu w fenolizowanym buforze fosforanowym, uzyskując koncentrat magazynowy, którego zawartość białka można oznaczyć analitycznie. Koncentrat jest następnie przepuszczany przez wirówkę Sharplesa w celu usunięcia niepożądanego materiału o wysokiej masie cząsteczkowej i rozcieńczany do dowolnej wymaganej mocy za pomocą glicerolowanego, fenolizowanego buforu fosforanowego. Po przejściu przez filtry Sterilmats gotowa tuberkulina jest ponownie standaryzowana analitycznie i wydawana na podstawie zawartości mg Oczyszczonej Pochodnej Białkowej na ml, z dokładnością do 1%.

 

Postać sucha

 

Jeśli preparat ma być uzyskany w postaci suchej, koncentrat po wirówce Sharplesa ponownie wytrąca się kwasem trichlorooctowym, następnie płucze wodą, potem jednorazowo acetonem, a na końcu kilkakrotnie eterem. Po odparowaniu eteru przy odpowiednim mieszaniu uzyskuje się Oczyszczoną Pochodną Białkową w postaci lekkiego, puszystego proszku o barwie jasnobrązowej, łatwo rozpuszczalnego w lekko alkalicznej wodzie. Preparat można otrzymać w nieco mniej czystej postaci poprzez suszenie sublimacyjne wilgotnego białka, a w jeszcze czystszej formie (około 99%) poprzez wprowadzenie dodatkowych etapów wytrącania: kwasem metafosforowym (w celu usunięcia resztkowych polisacharydów), siarczanem amonu (w celu usunięcia kwasów nukleinowych), przed końcowym płukaniem i suszeniem.

Zwykłe, rutynowo wydawane preparaty Weybridge zawierają obecnie 2 mg standardowej Oczyszczonej Pochodnej Białkowej na ml w przypadku odmiany hominis. Odpowiada to standardowi międzynarodowemu, tj. zawiera 100.000 „jednostek tuberkulinowych” na ml. Standaryzacja biologiczna przeprowadzana jest na świnkach morskich (zwykle 12), uczulonych organizmami homologicznie odpowiadającymi tym użytym do przygotowania Oczyszczonej Pochodnej Białkowej i opiera się na liniowej zależności między średnicą odczynu a logarytmem stężenia, w zakresie stężeń dających reakcje o odpowiednim charakterze. W ciągu ponad ośmiu lat produkcji na bardzo dużą skalę standaryzacja biologiczna ani razu nie pozostawała w sprzeczności ze standaryzacją chemiczną. Test na 12 świnkach morskich, porównujący znane roztwory Oczyszczonej Pochodnej Białkowej i analizowany statystycznie, daje wyniki mieszczące się w przedziale od 80 do 130 przy standardzie przyjętym jako 100. Test na 50 świnkach morskich zawęża granice ufności do ±10%. Przy użyciu kilkuset zwierząt prawdopodobnie osiągnięto by dokładność ±1%, charakterystyczną dla standardowej standaryzacji chemicznej.

 

SWOISTOŚĆ TUBERKULIN ORAZ OCZYSZCZONYCH POCHODNYCH BIAŁKOWYCH

 

W praktyce medycznej zakażenia Mycobacterium tuberculosis mają niemal zawsze pochodzenie ssacze, a zakażenia nieswoistymi bakteriami kwasoopornymi, które mogłyby zaburzać interpretację próby Mantoux, są tak rzadkie, że niewiele uwagi poświęcono właściwościom swoistości (w odróżnieniu od mocy działania) stosowanych tuberkulin. W praktyce weterynaryjnej problem jest jednak inny, należy uwzględnić gruźlicę ptasią występującą wśród drobiu i przenoszoną z niego, a także częste zakażenia bydła bakteriami kwasoopornymi innymi niż M. tuberculosis bovis, zwłaszcza M. avium i M. johnei. Istotne jest ich rozróżnienie, dlatego stosowany obecnie do użytku urzędowego przez Ministerstwo Rolnictwa „pojedynczy śródskórny test porównawczy” wykorzystuje dwie tuberkuliny – ssaczą i ptasią – podawane jednocześnie w niewielkiej odległości od siebie na szyi. Celem jest odróżnienie bydła z zakażeniami „nieswoistymi”, które nie mają znaczenia ekonomicznego ani zdrowotnego dla ludzi, od zakażeń bydlęcych wywołujących postępującą chorobę, którą należy eliminować. Metoda interpretacji ma charakter empiryczny i nie wymaga tu szczegółowego opisu, jednak pozwala zmniejszyć liczbę zwierząt, które musiałyby zostać usunięte ze stad kwalifikowanych w ramach programu „Attested Herds Scheme”, bez obniżenia skuteczności testu w wykrywaniu rzeczywistych reakcji bydlęcych.

REAKCJE KRZYŻOWE I „LICZBA SWOISTOŚCI”

 

Tuberkulina lub pochodna białkowa typu tuberkuloproteiny, przygotowana z niemal dowolnego Mycobacterium, wywołuje reakcje krzyżowe u zwierząt uczulonych przez niemal każdy inny gatunek, jednak siła reakcji jest znacząco różna dla preparatu homologicznego i heterologicznego. Na tej podstawie możliwe jest przypisanie każdemu preparatowi tzw. „liczby swoistości” względem danego typu zakażenia. Termin „liczba swoistości” został zdefiniowany jako: „liczba jednostek heterologicznej pochodnej białkowej potrzebna do wywołania takiej samej reakcji śródskórnej u zakażonych świnek morskich, jak jedna jednostka pochodnej homologicznej”

W tabeli poniżej, zaczerpniętej z wcześniej wspomnianego artykułu o „tuberkulinach w postaci Oczyszczonej Pochodnej Białkowej Weybridge”, przedstawiono liczby swoistości dla serii oczyszczonych pochodnych białkowych uzyskanych z sześciu różnych bakterii kwasoopornych, przygotowanych w 1943 roku w Laboratorium Weterynaryjnym Ministerstwa Rolnictwa. W trakcie przygotowywania danych uczulenie zwierząt uzyskiwano poprzez zakażenie żywymi drobnoustrojami, symulujące naturalny przebieg choroby, w przypadku odmian hominis, bovis i avium. W przypadku pozostałych trzech, niepatogennych dla świnki morskiej, uczulenie wywoływano poprzez wstrzyknięcie dużych dawek drobnoustrojów w oleju.

 

Tabela czynników swoistości

Typ uczulenia	Ludzki (Human)	Byczy (Bovine)	BCG	Ptasia (Avian)	Johne	Phlei
Ludzki (Human)	1	½	2	20	30	150
Byczy (Bovine)	1	1	2	40	30	150
BCG	1	½	1	20	30	150
Ptasia (Avian)	20	40	40	1	3	100
Johne	10	10	10	3	1	50
Phlei	150	150	150	100	50	1

Tabela pokazuje, jak różne szczepy Mycobacterium reagują krzyżowo na różne typy Oczyszczonej Pochodnej Białkowej. Wartość 1 oznacza najwyższą swoistość (reakcja homologiczna). Wyższe liczby oznaczają słabszą reaktywność krzyżową (potrzeba więcej jednostek, by uzyskać ten sam efekt).

 

Dane te mają charakter ilustracyjny, ukazujący zasadę leżącą u podstaw stosowania „liczb swoistości”, a nie stanowią ścisłych i niezmiennych wartości, dlatego należy je interpretować ostrożnie. Odnosi się to do „jednostek wagowych” konkretnych preparatów Oczyszczonej Pochodnej Białkowej w postaci suchego proszku. Wartość 20 dla ludzki Oczyszczonej Pochodnej Białkowej u świnek morskich uczulonych szczepem ptasim, lub 20 dla ptasiej Oczyszczonej Pochodnej Białkowej u świnek uczulonych szczepem ludzkim, dotyczy konkretnych użytych proszków O.P.B. i może się różnić w zależności od badanego preparatu. Oczyszczona Pochodna Białkowa pochodzenia ludzkiego, o ile wiadomo, wykazuje bardzo stałe właściwości i w każdym przypadku może być biologicznie standaryzowana pod względem aktywności przy uczuleniu homologicznycm względem arbitralnie przyjętego międzynarodowego standardu. Natomiast Oczyszczona Pochodna Białkowa uzyskiwana z Mycobacterium tuberculosis avium wykazują znaczne zróżnicowanie właściwości w zależności od szczepu i nie istnieje dla nich międzynarodowy standard odniesienia. Jedynym standardem jest standard Weybridge, uzyskany z wysoko swoistego szczepu D4 i przechowywany w postaci suchego proszku jako materiał referencyjny. Gdyby ten lub inny odpowiedni standard został przyjęty jako międzynarodowy przez weterynaryjny komitet standaryzacyjny Światowej Organizacji Zdrowia, możliwe byłoby wyrażanie liczb swoistości w jednostkach biologicznych, niezależnie od zmienności właściwości pochodnych białkowych różnych szczepów oraz od charakteru tuberkulin typu Stara Tuberkulina. Pozwoliłoby to określać „swoistość” dowolnej tuberkuliny komercyjnej niezależnie od jej „aktywności” oraz od ilości domniemanego składnika czynnego.

W literaturze medycznej często spotyka się używanie terminów „swoistość” i „aktywność” tak, jakby oznaczały to samo, a dany preparat określany jest jako bardziej swoisty, podczas gdy w rzeczywistości zawiera on jedynie większą ilość składnika aktywnego. Znaczna część nieporozumień dotyczących względnych zalet Starej Tuberkuliny i Oczyszczonej Pochodnej Białkowej wynika z tego błędnego rozumienia. Należy podkreślić, że pojęcie „swoistości” ma znaczenie wyłącznie w odniesieniu do zakażeń wywołanych przez prątki (Mycobacteria) heterologiczne względem tego, z którego przygotowano tuberkulinę, a być może również w odniesieniu do sposobu uczulenia świnek morskich wykorzystywanych w testach. Można by bez trudu przedstawić serię „tuberkulin” w postaci płynnej, oznaczonych jedynie numerami, które przy badaniu na zestawie świnek morskich uczulonych szczepem ludzkim dawałyby identyczne wyniki (mierzone średnicą odczynu śródskórnego), lecz ujawniałyby zasadnicze różnice przy testowaniu homologicznycm, każda na świnkach uczulonych szczepem, z którego została otrzymana.

Możliwe jest również przedstawienie serii tuberkulin różnego pochodzenia, których liczby swoistości różnią się w zależności od tego, czy badania przeprowadzono na zwierzętach uczulonych poprzez zakażenie, czy poprzez wstrzyknięcie martwych drobnoustrojów w oleju. Pewne obserwacje poczynione w Weybridge sugerują taką możliwość, choć dane wymagają dalszego wyjaśnienia. Stan alergiczny zwierzęcia może bowiem różnić się jakościowo, jak i ilościowo, w zależności od zastosowanego sposobu uczulenia. Nawet przy tym samym typie uczulenia zależność między średnicą odczynu a logarytmem dawki może być liniowa jedynie w określonych granicach. Dlatego też uważam, że najbardziej racjonalną metodą oznaczania aktywności tuberkulin jest badanie na uczuleniach homologicznych, uzyskanych o ile to możliwe drogą zakażenia oraz przy użyciu serii rozcieńczeń możliwie najbardziej zbliżonych do tych, które będą stosowane później w procedurach diagnostycznych, dla których dana tuberkulina jest przeznaczona.

W badaniach nad tuberkuloproteinami prątków (Mycobacteria) w ogólności, a właściwie nad frakcjami białkowymi analogicznymi do tych obecnych w tuberkulinie, nie jest możliwe zastosowanie naturalnych procesów zakaźnych w celu uzyskania uczulenia przy użyciu gatunków niepatogennych, takich jak M. phlei. W związku z tym termin „liczba swoistości” może mieć pewne wątpliwe znaczenie w przypadku porównań między organizmami patogennymi i niepatogennymi dla danego zwierzęcia testowego.

W ostatnich latach rozpowszechniła się metoda uczulania świnek morskich martwymi prątkami w oleju i jest ona oczywiście bardzo wygodna, ponieważ nie wywołuje postępującej choroby, a duża liczba zwierząt może zostać uczulona jednocześnie i wykorzystywana w dowolnym czasie przez długi okres. W niektórych przypadkach stosowano również martwe drobnoustroje heterologiczne względem badanej tuberkuliny. Metoda ta jest dopuszczalna w badaniach nad „swoistością” jedynie wtedy, gdy wcześniej przeprowadzono dokładne porównania z uczuleniem uzyskanym drogą zakażenia.

Obecnie w Weybridge wygodna technika z użyciem martwych drobnoustrojów stosowana jest do porównywania „aktywności” różnych partii Oczyszczonej Pochodnej Białkowej, które wiadomo, że zostały przygotowane w identyczny sposób, np. tuberkulina produkcyjna ze szczepu ludzkiego porównywana ze standardowym proszkiem Oczyszczonej Pochodnej Białkowej tego samego szczepu, lub tuberkulina produkcyjna szczepu ptasiego D4 porównywana ze standardem D4. Natomiast w przypadkach, gdy „swoistość” budzi wątpliwości, badania przeprowadza się na świnkach morskich uczulonych drogą zakażenia.

Kwestia ta ma szczególne znaczenie w praktyce weterynaryjnej, zwłaszcza w odniesieniu do stosowania tuberkulin w postaci Oczyszczonej Pochodnej Białkowej typu „ssaczego” i „ptasiego” w „pojedynczym śródskórnym teście porównawczym” Ministerstwa Rolnictwa. Test ten opiera się na właściwościach swoistości czynników diagnostycznych w celu odróżnienia bydła, które można bezpiecznie pozostawić w stadzie kwalifikowanym, od zwierząt, które muszą zostać usunięte. Oczywiste jest, że tuberkulina ptasia o niskiej liczbie swoistości dawałaby całkowicie mylące wyniki i byłaby gorsza niż bezużyteczna. Niezależnie od tego, czy kwestia swoistości tuberkulin ma znaczenie w praktyce medycznej, czy nie, wydaje się ona co najmniej interesująca z naukowego punktu widzenia, zwłaszcza w kontekście możliwości wykorzystania swoistych pochodnych białkowych do ustalenia, czy dodatni wynik próby Mantoux wynika z zakażenia typu hominis, czy też z zakażenia jednym z niedawno opisanych typów „gruźlicy skóry”, takich jak prątek Bairnsdale (Mycobacterium ulcerans).

 

PODSUMOWANIE

 

(1) Przedstawiono postulat zaprzestania stosowania „starej tuberkuliny” (Old Tuberculin) w medycynie i zastąpienia jej „oczyszczoną pochodną białkową”. W praktyce weterynaryjnej taka zmiana postępuje szybko.

(2) Oczyszczone Pochodne Białkowe o stałych właściwościach, zawierające około 90% właściwej tuberkuloproteiny w stanie suchym, można łatwo otrzymać przy użyciu bardzo prostej „techniki Weybridge”. W razie potrzeby możliwe jest uzyskanie jeszcze wyższego stopnia oczyszczenia. W standardowej postaci preparat o stężeniu 2 mg/ml odpowiada międzynarodowemu standardowi starej tuberkuliny, czyli 100.000 jednostek na ml. Roztwory można dokładnie standaryzować metodami chemicznymi, unikając dużej zmienności charakterystycznej dla standardowych metod biologicznych. Ze względu na duże straty składnika aktywnego podczas zagęszczania cieplnego pożywek hodowlanych, tuberkulina w postaci Oczyszczonej Pochodnej Białkowej jest znacznie tańsza w produkcji niż Stara Tuberkulina.

(3) Krytyce poddano specyfikacje zarówno dla starej tuberkuliny, jak i tuberkuliny typu pochodnej białkowej zawarte w British Pharmacopoeia oraz Pharmaceutical Codex.

(4) Omówiono rozróżnienie między „aktywnością” a „swoistością” oraz wyjaśniono znaczenie terminu „liczba swoistości”.

(5) Wskazano zastosowanie tuberkulin w postaci Oczyszczonej Pochodnej Białkowej typu ssaczego i ptasiego w różnicowaniu zakażeń swoistych i nieswoistych u bydła w ramach programu zwalczania gruźlicy prowadzonego przez Ministerstwo Rolnictwa.

Źródło: Proc R Soc Med. 1951 Dec;44(12):1045–1054;May 16, 1951 DISCUSSION ON TUBERCULINS IN HUMAN AND VETERINARY MEDICINE

 

Zobacz na: Historia pojęcia i koncepcji alergii
Diagnostyka gruźlicy wreszcie wkracza w XXI wiek