Wykrycie retrowirusa zakaźnego XMRV w komórkach krwi pacjentów z zespołem chronicznego zmęczenia – dr Judy A. Mikovits i inni.
Źródło: Virulence. 2010 Wrzesień-Październik; 1(5): 386-390.
[XMRV (ang. xenotropic murine leukemia virus-related virus) – gammaretrowirus.]
Dr Judy Mikovits – szczepionki zanieczyszczone retrowirusami!
Streszczenie
W październiku 2009 roku zgłosiliśmy pierwsze bezpośrednie wyizolowanie zakaźnego wirusa XMRV (ang. xenotropic murine leukemia virus-related virus, pl. ksenotropowy wirus spokrewniony z wirusem białaczki myszy). W badaniu tym wykorzystaliśmy połączenie metod amplifikacji biologicznej i wzmocnienia cząsteczek do wykrycia XMRV u ponad 75% spośród 101 pacjentów chorych na zespół przewlekłego zmęczenia (CFS, ang. chronic fatigue syndrome). Od czasu pojawienia się naszego raportu narosły kontrowersje po opublikowaniu wyników badań, które nie wykryły zakażenia wirusem XMRV w populacji pacjentów z CFS. W niniejszym załączniku dodatkowo omówimy w szczegółach liczne metody wykrywania, które zastosowaliśmy, aby zaobserwować zakażenie XMRV w kohorcie pacjentów z CFS. Nasze wyniki wskazują, że reakcja łańcuchowa polimerazy DNA (ang. polymerase chain reaction, PCR) niestymulowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej PBMC (ang. peripheral blood mononuclear cell) jest najmniej czułą metodą wykrywania XMRV we krwi osób poddanych badaniu. W kolejnych badaniach znaczenia XMRV dla chorób człowieka proponujemy zastosowanie więcej niż jednego rodzaju testu w celu określenia częstotliwości zakażenia XMRV.
Wykrycie retrowirusa zakaźnego XMRV w komórkach krwi pacjentów z zespołem chronicznego zmęczenia
Dobór pacjentów stanowi wyzwanie w przypadku każdego badania dotyczącego zespołu przewlekłego zmęczenia (ang. myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome, ME/CFS). Do naszego badania z października 2009 roku wybraliśmy przechowywane w banku w latach 2006-2008 próbki krwi poważnie chorych pacjentów spełniających kryteria diagnostyczne Fukudy[1] z 1994 roku zalecane przez Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (ang. Centers for Disease Control and Prevention, CDC), a także Canadian Consensus Criteria (CCC) z 2003 roku dla zespołu chronicznego zmęczenia.[2] Kryteria CCC wymagają wystąpienia niemocy wysiłkowej, co do której wielu klinicystów uważa, że stanowi warunek konieczny ME/CFS. Ponadto, CCC wymagają również, aby pacjenci zdradzali objawy zmęczenia po wysiłku, snu nieregenerującego, objawy bólowe oraz objawy neurologiczne/kognitywne, które nie powinny być wyłącznie opcjonalnymi symptomami.[3] Wielu klinicystów zainteresowanych CFS przechodzi na kryteria kanadyjskie, ponieważ uważają, że lepiej opisują one definiowaną jednostkę kliniczną. Kryteria Fukudy mają tę przewagę, że są w użyciu dłużej niż kanadyjskie i powstały liczne opracowania, które dodały do nich modyfikacje. Wystarczy powiedzieć, że będący klinicystą autor publikacji zamieszczonej w Science postanowił, że będzie stosował oba rodzaje kryteriów, omijając tym samym spór, które z nich są lepsze. Co więcej, w artykule w czasopiśmie Science nacisk położony był na wirusologię, nie zaś na opis kliniczny ME/CFS.
W naszej publikacji z października 2009 roku stwierdziliśmy obecność zakażenia wirusem XMRV w produktach krwi naszej populacji pacjentów za pomocą pięciu różnych metod. Spośród nich, pojedyncza reakcja łańcuchowa polimerazy DNA komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, najmniej czuła z tych metod, wymagała od nas użycia próbek od podgrupy przewlekle chorych pacjentów, u których zaobserwowaliśmy uporczywą wiremię. Na rycinie 1A naszego artykułu w Science wykazaliśmy, że w DNA siedmiu z jedenastu pacjentów stwierdzono obecność produktów amplifikacji PCR gag i env w wyniku pojedynczej reakcji PCR z użyciem starterów XMRV. Umieściliśmy tę rycinę w opracowaniu, aby zademonstrować, że metoda gniazdowej PCR, która nieuchronnie rodzi pytania o zanieczyszczenie, nie jest konieczna do wykrycia XMRV u pacjentów z ostrą wiremią cierpiących na ME/CFS. Pozostałych 90 próbek opisanych w tej publikacji wykazywało obecność bardzo niewielu genów gag wirusa XMRV będących produktami reakcji PCR i ani jednego genu env jako produktu reakcji PCR na skutek zastosowania metody pojedynczej reakcji PCR DNA niestymulowanych PBMC. Dla kontrastu, po otrzymaniu cDNA (ang. complementary DNA, pl. komplementarne DNA), 67% próbek wykazywało obecność produktów gag w wyniku zastosowania metody gniazdowej PCR, mimo że metoda PCR z użyciem starterów wewnętrznych env nie doprowadziła do pojawienia się możliwych do wykrycia produktów z tych próbek (Tabela 1).
Tabela 1
Wykrycie wirusa XMRV z użyciem cDNA z 22 niestymulowanych PBMC
| \ | Gen gag | Gen env | |||||
| Próbka | 1 | 2 | Próbka | 1 | 2 | ||
| 1 | − | − | Normalny | 1 | − | − | Normalny |
| 2 | − | + | 1104 | 2 | − | − | 1104 |
| 3 | + | + | 1110 | 3 | − | − | 1110 |
| 4 | − | − | 1113 | 4 | − | − | 1113 |
| 5 | − | − | 1114 | 5 | − | − | 1114 |
| 6 | − | + | 1115 | 6 | − | + | 1115 |
| 7 | − | − | 1117 | 7 | − | − | 1117 |
| 8 | − | + | 1125 | 8 | − | − | 1125 |
| 9 | − | + | 1130 | 9 | − | − | 1130 |
| 10 | + | + | 1135 | 10 | − | − | 1135 |
| 11 | − | − | 1142 | 11 | − | − | 1142 |
| 12 | + | + | 1150 | 12 | − | − | 1150 |
| 13 | − | − | 1155 | 13 | − | − | 1155 |
| 14 | − | + | 1161 | 14 | − | − | 1161 |
| 15 | − | + | 1165 | 15 | − | − | 1165 |
| 16 | − | + | 1166 | 16 | − | − | 1166 |
| 17 | + | + | 1168 | 17 | − | − | 1168 |
| 18 | − | + | 1169 | 18 | − | − | 1169 |
| 19 | − | + | 1177 | 19 | − | − | 1177 |
| 20 | − | + | 1178 | 20 | − | − | 1178 |
| 21 | − | − | 1182 | 21 | − | − | 1182 |
| 22 | − | − | 1199 | 22 | − | − | 1199 |
Próbki nie wykazujące obecności wirusa XMRV po zastosowaniu jednego z naszych testów PCR dają niekiedy wynik pozytywny w innych testach. Dla przykładu na Rycinie 1A w artykule w Science, pacjent z numerem 1118 uzyskał wynik negatywny na skutek zastosowania pojedynczej reakcji łańcuchowej polimerazy DNA z niestymulowanych PBMC, ale pozytywny w innych testach (Science Ryc. 2A i D, 4A i S5). Spośród 34 pacjentów, których PBMC wykazały brak wirusa XMRV w testach PCR DNA lub cDNA, 17 uzyskało wynik pozytywny na obecność wirusa zakaźnego, gdy PBMC wyhodowano z linią komórek wskaźnikowych nowotworu prostaty LNCaP, ponieważ w tej linii komórkowej wykryto obecność genów gag i env wirusa XMRV będących produktami reakcji PCR w następstwie zainfekowania ich wirusem XMRV z PBMC pacjentów (Tabela 2). Zarówno produkty gag, jak i env uzyskane czy to w wyniku pojedynczej czy gniazdowej PCR zostały zsekwencjonowane i wykazano, że są w 99% identyczne z XMRV VP62.
Tabela 2
Ko-hodowla z linią komórkową LNCaP z komórek PBMC dwunastu pacjentów, u których reakcja PCR wykazała brak genów env
| gen gag | gen env | |||||||
| Próbka | 1 | 2 | Próbka | 1 | 2 | Typ | ||
| 1 | − | − | Normalny | 1 | − | − | Normalny | cDNA |
| 2 | − | + | 1169 | 2 | + | + | 1169 | cDNA |
| 3 | + | + | 1221 | 3 | + | + | 1221 | cDNA |
| 4 | − | + | 1150 | 4 | + | + | 1150 | cDNA |
| 5 | − | + | 1199 | 5 | − | + | 1199 | cDNA |
| 6 | + | + | 1220 | 6 | + | + | 1220 | cDNA |
| 7 | − | − | LNCaP | 7 | − | − | LNCaP | cDNA |
| 8 | − | + | 1186 | 8 | − | + | 1186 | cDNA |
| 9 | − | + | 1132 | 9 | − | + | 1132 | DNA |
| 10 | − | + | 1111 | 10 | − | − | 1111 | DNA |
| 11 | − | + | 1189 | 11 | + | + | 1189 | DNA |
| 12 | − | + | 1172 | 12 | + | + | 1172 | DNA |
| 13 | − | + | 1173 | 13 | − | + | 1173 | DNA |
| 14 | − | + | 1103 | 14 | + | + | 1103 | DNA |
Po opublikowaniu naszego artykułu w październiku 2009 roku, ukazały się dwa opracowania z Wielkiej Brytanii [4,5] i jedno z Holandii [6], w których autorzy donoszą o niewykryciu wirusa XMRV na drodze reakcji PCR, której poddano DNA niestymulowanych PBMC z wykorzystaniem populacji pacjentów wybranych jedynie na podstawie kryteriów Fukudy lub kryteriów oksfordzkich, nie zaś zarówno na podstawie kryteriów Fukudy i CCC. Żałujemy, że autorzy ci nie zwrócili się do nas o pozytywne próbki kontrolne naszych pacjentów, u których stwierdzono wirus XMRV na drodze reakcji PCR nawet, gdy oceniono ich z użyciem najmniej czułej metody detekcji, a konkretnie reakcji PCR, której poddano niestymulowane PBMC. Biorąc pod uwagę fakt, że produkty te wykryto w wyniku zastosowania reakcji PCR z wykorzystaniem DNA w PBMC tylko 7% spośród naszych 101 pacjentów (Tabela 3 i 4), a także to, że w badaniach z Wielkiej Brytanii uwzględniono znaczną liczbę pacjentów niespełniających kryteriów CCC, należy się spodziewać, że bardzo niewiele próbek, o ile jakiekolwiek, wykaże wynik pozytywny na skutek poddania DNA reakcji PCR. Zauważamy również, że w obu badaniach wykorzystano inne niż zastosowane przez nas metody pobierania krwi, ilości oraz izolowania DNA, jak również PCR, co mogło być przyczyną odmiennych wyników. Wyniki detekcji wirusa XMRV 101 pacjentów znajdują się w Tabeli 4.
Tabela 3
Zestawienie licznych testów na obecność wirusa przeprowadzonych na grupie 57 pacjentów
| Niestymulowane PBMC | Stymulowane PBMC | LNCaP wyhodowane z innymi komórkami | Serologia | Niestymulowane PBMC | |||
| Zagnieżdżony gag | Zagnieżdżony gag | Zagnieżdżony gag | Przeciwciało skierowane przeciwko env | Produkt gag otrzymany w pojedynczym etapie reakcji PCR | |||
| cDNA | DNA | cDNA | – | cDNA | – | Osocze | DNA |
| 31/57 | 44/205* | 41/57 | – | 51/57 | – | 47/57 | 4/57 |
| 54% | 21% | 72% | – | 89% | – | 82% | 7% |
*liczne próbki DNA pobrane od niektórych spośród 57 pacjentów w różnych dniach.
Tabela 4
Wyniki detekcji wirusa XMRV u 101 pacjentów
| ID pacjenta | Amplifikacja cDNA metodą zagnieżdżonej PCR | Amplifikacja DNA metodą zagnieżdżonej PCR | LNCaP wyhodowane z PBMC | Przeciwciało w osoczu | Kultura LNCaP z osoczem |
| 1103 | + | + | + | + | + |
| 1104 | + | + | + | + | + |
| 1105 | + | − | + | + | + |
| 1106 | + | + | + | + | + |
| 1107 | + | − | − | NZ* | NZ |
| 1108 | + | − | − | − | − |
| 1109 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1110 | + | − | + | + | + |
| 1111 | + | + | + | − | + |
| 1112 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1113 | + | − | + | NZ | NZ |
| 1114 | + | − | NZ | NZ | + |
| 1115 | + | − | + | + | + |
| 1116 | − | − | NZ | NZ | + |
| 1117 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1118 | + | − | + | + | + |
| 1119 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1120 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1121 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1124 | + | − | − | − | − |
| 1125 | + | − | + | + | + |
| 1126 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1127 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1128 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1129 | + | − | NZ | − | NZ |
| 1130 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1131 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1132 | + | + | + | NZ | NZ |
| 1133 | + | + | NZ | NZ | NZ |
| 1134 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1135 | + | + | NZ | NZ | NZ |
| 1136 | + | + | − | + | + |
| 1137 | + | + | − | + | + |
| 1265 | + | − | + | + | + |
| 1138 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1335 | + | − | NZ | + | + |
| 1139 | − | − | − | − | − |
| 1140 | + | − | NZ | − | + |
| 1141 | + | − | + | + | + |
| 1142 | − | − | NZ | NZ | + |
| 1206 | + | − | NZ | − | + |
| 1144 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1145 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1148 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1149 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1150 | + | + | + | + | + |
| 1151 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1230 | + | − | + | NZ | NZ |
| 1237 | + | − | + | NZ | NZ |
| 1154 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1155 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1156 | − | − | NZ | NZ | + |
| 1157 | + | + | NZ | NZ | NZ |
| 1158 | + | − | − | + | + |
| 1159 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1231 | + | − | + | NZ | NZ |
| 1161 | + | − | − | + | + |
| 1220 | + | − | + | NZ | NZ |
| 1221 | + | − | + | NZ | + |
| 1164 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1165 | + | − | + | + | + |
| 1166 | + | − | − | + | + |
| 1167 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1168 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1169 | + | − | + | + | + |
| 1170 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1235 | − | − | + | NZ | NZ |
| 1281 | + | − | + | + | + |
| 1172 | + | + | + | + | + |
| 1282 | + | − | − | − | + |
| 1173 | + | + | + | + | + |
| 1174 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1175 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1176 | − | − | NZ | NZ | NZ |
| 1177 | + | − | + | + | + |
| 1178 | + | − | + | + | + |
| 1179 | + | − | NZ | − | + |
| 1180 | − | − | NZ | + | + |
| 1181 | + | − | NZ | NZ | NZ |
| 1182 | − | − | NZ | + | + |
| 1183 | + | − | − | − | + |
| 1236 | + | − | + | NZ | NZ |
| 1224 | + | − | NZ | NZ | + |
| 1186 | + | + | + | + | + |
| 1187 | − | − | NZ | + | + |
| 1188 | + | − | + | + | + |
| 1189 | + | + | + | + | + |
| 1190 | + | − | + | + | + |
| 1191 | + | − | + | + | + |
| 1192 | + | + | NZ | + | + |
| 1193 | + | + | NZ | + | + |
| 1194 | + | − | NZ | − | + |
| 1238 | + | − | + | + | + |
*NZ, nie zbadano. Uwaga: Nie wszystkie próbki i/lub pacjentów poddano wszystkim rodzajom testów.
Artykuły relacjonujące negatywne wyniki testów PCR na obecność wirusa XMRV zrodziły pytania czy nasze ustalenia mogły być skutkiem zanieczyszczenia doświadczeń uwzględniających reakcję łańcuchową polimerazy DNA genomowym myszy, które zawiera sekwencje genów gag i env wysoce przypominające wirus XMRV. Dodatnie wyniki testów PCR na obecność wirusa XMRV uzyskano niezależnie w licznych laboratoriach prowadzonych przez współautorów artykułu w Science. Latem 2006 roku, przed rozpoczęciem eksperymentów dotyczących XMRV w Reno Whittemore-Peterson Institute (WPI), od pacjentów zamieszkałych w USA, Kanadzie i Europie przybywających na leczenie w renomowanej klinice Sierra Internal Medicine z siedzibą w Incline Village w stanie Nevada pobrano 30 mL heparynizowanej krwi obwodowej. Zaraz po pobraniu, 48 z tych próbek krwi wysłano bezpośrednio do NCI (ang. National Cancer Institute, Narodowy Instytut Raka), gdzie cDNA zostało przygotowane do planowanych doświadczeń z wykorzystaniem mikromacierzy. Po zaobserwowaniu w 2009 roku przez naukowców z WPI produktu PCR w postaci XMRV w próbce krwi pacjenta, NCI rozpoczął sprawdzanie tych przechowywanych próbek metodą PCR. W cDNA w 42 spośród 48 próbek wysłanych do laboratorium NCI w lutym 2007 roku stwierdzono obecność genu gag wirusa XMRV przy użyciu metody gniazdowej PCR. Ani laboratorium WPI ani NCI, gdzie przeprowadzono test PCR, nie pracowało wcześniej na tkankach myszy ani też nie miało do czynienia z XMRV z innych źródeł. Sekwencje genu env amplifikowane z komórek LNCaP zainfekowanych PBMC wykazują mniejsze podobieństwo do DNA genomowego myszy niż wirus XMRV VP62, co dodatkowo wskazuje na obecność infekcji wirusem XMRV, nie zaś na zanieczyszczenie DNA genomowym myszy. Po tym, jak opracowaliśmy czułą metodę oceny hodowli komórkowych służącą detekcji XMRV, oceniliśmy nasze linie komórkowe oraz materiał pobrany od pacjentów za pomocą wysoce czułego testu (opracowanego i udostępnionego dzięki życzliwości Billa Switzera, CDC), aby wykryć obecność zanieczyszczenia tkankami myszy poprzez rozpoznanie oksydazy cytochromowej w mitochondriach myszy za pomocą metody PCR w czasie rzeczywistym. Wszystkie linie komórkowe, jak też materiały pobrane od 101 pacjentów dały wynik negatywny na obecność zanieczyszczenia tkankami myszy.
Z naszego doświadczenia zdobytego dzięki zastosowaniu licznych metod wobec tych samych 57 próbek krwi, wynika, że najbardziej czułymi metodami analitycznymi wykorzystującymi krew, które służą detekcji XMRV są w kolejności malejącej (Tabela 3): (1) przeprowadzenie gniazdowej PCR dla sekwencji genów gag w komórkach LNCaP, które zostały wyhodowane wspólnie z osoczem osób badanych lub z aktywowanymi PBMC, (2) obecność przeciwciał przeciwko genom Env wirusa XMRV w osoczu osoby badanej, (3) obecność produktów gag wykrytych za pomocą gniazdowej PCR na stymulowanych PBMC bądź detekcja białek wirusowych kodowanych przez aktywowane PBMC przy pomocy odpowiednich antysurowic, (4) metoda gniazdowej PCR w czasie rzeczywistym na kwasie nukleinowym lub PCR na cDNA z komórek PBMC i (5) PCR na DNA nieaktywowanych PBMC spreparowanych z krwi osoby poddanej badaniu.
Mimo związku zarówno z rakiem prostaty, jak i CFS, wciąż brakuje odpowiedzi na pytania o częstość występowania wirusa XMRV w populacji ludzkiej, zachorowalność spowodowaną zakażeniem tym wirusem, a także zakres zmienności genetycznej pomiędzy jego izolatami. Aktualnie rozpoznana zmienność genetyczna między izolatami XMRV wynosi zaledwie 0,03% pomimo faktu, że sekwencje wirusów uzyskano z izolatów pochodzących z dwóch całkowicie różnych chorób pacjentów zamieszkałych na terenach odmiennych pod względem geograficznym. Zmienność ta jest mniejsza niż zaobserwowana między izolatami wirusa HTLV-1.[7] Tak jak w przypadku HTLV, brak zróżnicowania wskazuje, że wirus XMRV niedawno zstąpił od wspólnego przodka.[8] Wysoki stopień podobieństwa do ksenotropowego wirusa spokrewnionego z wirusem białaczki myszy sugeruje, że w trakcie ewolucji XMRV miała prawdopodobnie miejsce transmisja międzygatunkowa.[9] Dalsze badania wirusa XMRV pochodzącego od ludzi mogą uwidocznić bardziej rozbudowaną zmienność sekwencji, co może także skomplikować proces detekcji tego wirusa, o ile przy projektowaniu starterów PCR nie weźmie się pod uwagę tej możliwości.
Przypisy:
1. Fukuda K, Straus S, Hickie I, Sharpe MC, Dobbins JG, Komaroff A. The chronic fatigue syndrome: A comprehensive approach to its definition and study. Ann Intern Med. 1994;121:953–959
2. Carruthers B, Jain A, DeMeirlier K, Peterson DL, Klimas NG, Lerner AM, et al. Myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome: Clinical working case definition. diagnostic and treatment protocols. J Chronic Fatigue Syndrome. 2003;11:1–12. [Wykrycie retrowirusa zakaźnego XMRV w komórkach krwi pacjentów z zespołem chronicznego zmęczenia]
3. Jason L, Torres-Harding S, Jurgens A, Helgerson J. Comparing the Fukuda et al. criteria and the Canadian definition for chronic fatigue syndrome. J Chronic Fatigue S. 2004;12:37–52.
4. Erlwein O, Kaye S, McClure MO, Weber J, Wills G, Collier D, et al. Failure to detect the novel retrovirus XMRV in chronic fatigue syndrome. PLoS One. 5:8519.
5. Groom HC, Boucherit VC, Makinson K, Randal E, Baptista S, Hagan S, et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7
6. van Kuppeveld FJ, de Jong AS, Lanke KH, Verhaegh GW, Melchers WJ, Swanink CM, et al. Prevalence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in patients with chronic fatigue syndrome in the Netherlands: retrospective analysis of samples from an established cohort. BMJ. 340:1018.
7. Ratner L, Philpott T, Towbridge DB. Nucleotide sequence analysis of isolates of Human T-lymphotropic virus type 1 of diverse georgraphical regions. AIDS Rs Hum Retroviruses. 1991;7:923–941.
Zobacz na: Ponad 30.000 opublikowanych badań może być błędne z powodu zanieczyszczonych komórek – Peter Dockrill
Spontaniczna integracja fragmentów ludzkiego DNA w genomie biorcy – dr Theresa A. Deisher, Kumiko Koyama
Film WIWISEKCJA – Śmiertelna medycyna [1997]