Technologie wytwarzania szczepionek

Szczepionki preparaty biofarmaceutyczne chroniące organizm przed czynnikami infekcyjnymi poprzez pobudzenie jego odpowiedzi immunologicznej.

Szczepionki klasyczne (I generacji) zabite (zinaktywowane) lub żywe, ale awirulentne (atenuowane) czynniki infekcyjne.

Czynnik infekcyjny jest hodowany in vitro, oczyszczany, a następnie inaktywowany lub atenuowany.

Szczepionki II generacji fragmenty czynników infekcyjnych (głównie białka, peptydy, oligo- i polisacharydy) indukujące odpowiedź immunologiczną wobec kompletnych czynników infekcyjnych lub preparaty DNA kodującego peptydy/białka wywołujące określoną odpowiedź immunologiczną.

Technologie wytwarzania szczepionek

 

Etapy procedury opracowywania nowej szczepionki

 

 Szczepionki klasyczne przeciwbakteryjne

Szczepionki żywe (atenuowane)

• Gruźlica ( (Mycobacterium tuberculosis) BCG (Bacillus Calinette-Guerin) atenuowane komórki M. bovis
• Tyfus ( (Salmonella typhi)

Szczepionki inaktywowane

• Tyfus (Salmonella typhi)
• Cholera (Vibrio cholerae)
• Koklusz ( (Bordetella pertussis)
• Borelioza ( (Borrelia spp.)

Przykłady szczepionek przeciwwirusowych z hodowli komórkowych

Szczepionki przeciwko grypie namnażanie wirusa w zarodkach jaj.

Wytwarzanie klasycznych szczepionek antywirusowych

Elementy niezbędne:

1. System komórkowy zapewniający możliwość prowadzenia hodowli w powtarzalnych warunkach, niezmienności genetycznej, wolnych od zanieczyszczeń. Alternatywa pierwotne kultury komórkowe.
2. Wirusy posiewowe, wolne od zanieczyszczeń innymi wirusami.
3. Właściwe podłoża hodowlane.
4. Wystandaryzowane procedury produkcyjne.

Linie komórkowe stosowane do produkcji szczepionek przeciwwirusowych

Systemy banków komórkowych – wyłącznie dla komórek mogących dzielić się w nieskończoność:

– linia Vero komórek z nerek małp;

– ludzkie komórki diploidalne (HDC) z fibroblastów płuc linie MRC-5 i WI-38

Pierwotne kultury komórkowe

Punkt wyjścia pojedyncze komórki uzyskiwane z tkanek dzięki zastosowaniu proteaz, hodowane następnie in vitro. Najpopularniejsze fibroblasty z zarodków kurzych

Zestawienie substancji i materiałów stosowanych do produkcji szczepionek przeciwwirusowych

Dodatki do podłoży kultur komórkowych	Czynniki wzrostu, najczęściej w postaci płodowej surowicy cieląt lub jej części składowych, albuminy surowicy, antybiotyki, wskaźniki pH (np. czerwień fenolowa)
Proteazy	Do zakładania hodowli pierwotnych i do uwalniania od powierzchni nośnikowych oraz oddzielania komórek, które uległy adhezji - najczęściej trypsyna
Substancje buforowe	Różne bufory do regulacji pH, rozcieńczania, oczyszczania, formułowania
Środki pomocnicze do oczyszczania	Sacharozowe roztwory gradientowe, matryce chromatograficzne, środki wytrącające
Stabilizatory	Buforowane, złożone roztwory np. z solami, cukrami, alkoholami cukrowymi, białkami, peptydami, aminokwasami itd.
Adiuwanty	Środki wzmacniające odpowiedź immunologiczną - najczęściej wodorotlenek glinu lub fosforan glinu; w medycynie weterynaryjnej również oleje mineralne i saponiny
Środki inaktywujące	Najczęściej formaldehyd lub Beta-propiolakton
Środki konserwujące	Tiomersal, Natriumtimerfonat, 2-fenoksyetanol
Woda	Woda najwyższego stopnia czystości do iniekcji
Pojemniki produktu końcowego	Ampułki i inne pojemniki wraz z zamknięciami, gotowe strzykawki

Surowce do produkcji szczepionek przeciwwirusowych
oraz systemy zapewnienia ich jakości.

Schemat procesu produkcji szczepionek wirusowych

Hodowle tkankowe komórek ssaczych

Rozmiary wirusa warunkują wybór technologii izolacji

Ultrawirowanie gradientowe w ciągłym procesie przepływowym

Inaktywacja

Najczęściej stosowane czynniki: formaldehyd i p-propionolakton;
Stężenia powyżej 0.05%
Formaldehyd – dłuższe czasy (kilka dni), podwyższona temperatura
Propionolakton – krótkie czasy, ulega rozkładowi w podwyższonej temperaturze

Formułowanie

Głównie postać płynna;
Często dodatek adiuwantów – np. soli glinu;
Stabilizatory żywych szczepionek – sorbitol, albumina, żelatyna. Szczepionkaprzeciw polio – 1 M MgCI2
Alternatywna postać – liofilizaty

Kontrola jakości

• podczas procesu (wszystkie etapy) i po jego zakończeniu
•  50 – 100 testów na szarżę;
•  testy na zwierzętach;
• procedury zapewniające identyczność warunków prowadzenia produkcji

 

Ograniczenia wytwarzania i stosowania szczepionek klasycznych

• Nie wszystkie czynniki infekcyjne można hodować in vitro;
• Wirusy muszą być hodowane w hodowlach komórkowych/tkankowych komórek zwierzęcych (koszty, małe wydajności);
• Konieczność stosowania drastycznych procedur ochronnych dla personelu; Niebezpieczeństwo zanieczyszczenia końcowych preparatów żywymi czynnikami infekcyjnymi;
• Szczepy atenuowane mogą rewertować do normalnych;
• Brak szczepionek dla wielu czynników infekcyjnych (np. wirus HIV);
• Problemy z zapewnieniem odpowiednich warunków przechowywania (głównie kraje tzw. III świata)

 

Szczepionki nowej generacji

• szczepionki subkomórkowe i podjednostkowe
• szczepionki DNA
• czynniki infekcyjne z usuniętymi genami warunkującymi wirulentność
• żywe, niepatogenne drobnoustroje jako wektory przenoszące i eksponujące na swojej powierzchni determinanty antygenowe czynników infekcyjnych
• rekombinowane białka zawierające determinanty antygenowe czynników infekcyjnych eksprymowane w komórkach innego gospodarza, np. E. coli

Szczepionki subkomórkowe i podjednostkowe

Determinanty antygenowe patogennych drobnoustrojów lub wirusów. Białka, polisacharydy lub koniugaty obu.

Koniugaty szczególnie efektywne w immunizacji dzieci do lat dwóch. Dzieci takie nie nie posiadają jeszcze wykształconego systemu humoralnego, rozpoznającego immunogeny w sposób niezależny od komórek limfocytów T (w tym polisacharydy).

Przykłady zaaprobowanych szczepionek:

-szczepionki subkomórkowe
Przeciw pneumokokom (Streptococcus pneumoniae), meningokokom, Hemophilus influenzae B (koniugat polisacharydu powierzchniowego i toksyny dyfterytu)

-szczepionki podjednostkowe
Przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B (rekombinowany antygen powierzchniowy wirusa wytwarzany przez drożdże lub kultury komórek ssaczych,

Zasada konstrukcji szczepionki podjednostkowej przeciwko wirusowi HSV

 

Szczepionki peptydowe – peptyd stanowiący kluczowy epitop antygenu. Konieczność łączenia z białkiem nośnikowym. Szczepionka weterynaryjna przeciwko FMDV

Zalety 

• zwiększenie bezpieczeństwa
• możliwość uzyskania wyższej czystości, łatwiejsza kontrola jakości, niższe koszty wytwarzania

Wady

• konieczność identyfikacji kluczowego antygenu
• często gorsza efektywność, konieczność powtarzania immunizacji i dodawania adiuwantów

 

Szczepionki DNA

DNA kodujące antygen

Problem: dostarczenie do komórek

Sposoby:

• nagie DNA, mikrocząstki, strzelba biolistyczna, liposomy
• wektory wirusowe
• wektory bakteryjne

Zalety potencjalnych szczepionek DNA

• brak konieczności izolacji antygenowego białka
• nie ma potrzeby hodowli patogennych drobnoustrojów
• brak moŝliwości rewersji atenuowanych patogenów
• stosunkowo tanie wytwarzanie i przechowywanie
• możliwość wprowadzenia do organizmu kilku genów kodujących róŝne białka przy pomocy tego samego wektora

Wykorzystanie niepatogennych komórek Shigella flexneri jako nośników DNA-szczepionki do komórek nabłonkowych

 

Strategia konstrukcji atenuowanej szczepionki przeciwko V. cholerae

Szczepionki w trakcie opracowywania

Antyinfekcyjne

AIDS, wirus Ebola, wirusy opryszczki (HSV-1 i HSV-2), malaria, grypa (nowe), Bacillus anthrax,, grużlica (nowe)

Inne

Nowotwory, antykoncepcyjne, cukrzyca, choroby autoimmunologiczne

Adiuwanty

Adiuwanty – czynniki (substancje) dodawane do preparatów szczepionek, których zadaniem jest wzmocnienie reakcji immunologicznej organizmu.

Skuteczne adiuwanty wzmagają reakcje immunologiczne poprzez:

• przedłużenie immunologicznego czasu połowicznego rozpadu antygenu szczepionki
• udoskonalony sposób podania i lepsze prezentowanie antygenu
• indukowanie produkcji cytokin działających immunomodulacyjnie

 

Adiuwanty cząstkowe

Adiuwant	Opis
Fosforan glinu - żel	Amorficzny hydroksyfosforan glinu
Wodorotlenek glinu - żel	Krystaliczny oksywodorotlenek glinu AlOOH, w mineralogii: bemit (boehmit)
Fosforan wapnia - żel	Fosforan wapnia
Kompleks - DOC/AI(OH)3	Kompleks sól sodowa kwasu deoksycholowego - Al(OH)3
Nanocząstki stałych lipidów (SLN®)	Ńanocząstki stałych lipidów (lipidy stałe w temp. pokojowej, emulgowane w temperaturze powyżej ich temperatury topnienia w roztworach tenzydowych) emulsje quasi-„stale"
Nanocząstki polimetylo- metakrylanu (PMMA)	Polimeryzacja emulsyjna metakrylanu metylu
GERBU Adjuvant	Mieszanina N-acetyloglukozoaminylo-(Beta1-4)-N- -acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminy, chlorku dimetylodioktadecyloamoniowego (DDA) i soli cynkowej L-proliny
ISCOMs® kompleksy immunostymulujące (immune stimulating complexes)	Kompleksy 0,5% saponin kwilai (mydłoki właściwej), 0,1% cholesterolu, 0,1% DMPC oraz antygenu w roztworze NaCl buforowanym fosforanem (PBS)
PODDS™	Mikrosfery proteinoidowe, acylowane aminokwasy
PLGA, PGA, PLA	Homo- i kopolimery kwasu mlekowego i glikolowego
Protein Cochleate	Trwałe zawiesiny białkowo-fosfolipidowo- wapniowe, duża zwinięta podwójna warstwa lipidowa, zwinięta spiralnie, bez wewnętrznej fazy wodnej

 

Adiuwanty tworzące emulsje

Kompletny adiuwant Freunda (CFA, FCA)	Mieszanina oleju mineralnego (Marco52) i emulgatora (Arlacel A) jako emulsja z 85% oleju mineralnego i 15% emulgatora wraz z 500 µg/ml Mycobacterium tuberculosis (po inaktywacji wysoką temperaturą i wysuszeniu)
Niekompletny adiuwant Freunda (IFA, FIA)	jw. bez M. tuberculosis
MF59	Emulsja O/W o składzie: skwalen (4,3%), Polisorbat 80 (0,25%) i SPAN 85 (0,25%), opcjonalnie z MTP-PE
SAF1	Emulsja O/W o składzie: skwalan (5%), Pluronic L121 (2,5%), Polisorbat 80 (0,2%), roztwór NaCl buforowany fosforanem i treonylo-MDP (0,05-1%)
Montanide ISA 720	Mieszanina monooleinianu mannitolu i naturalnego, podlegającego metabolizmowi oleju, przy mieszaniu z roztworem antygenu powstaje emulsja W/O
Adjuvant 65	Emulsja W/O oleju arachidowego, monooleinianu mannitolu oraz wody

 

Liposomy jako adiuwanty

Adiuwant	Opis
Niejonowe pęcherzyki surfaktantu	Wielowarstwowe pęcherzyki zbudowane z mieszaniny niejonowych tenzydów (np. 1-monopalmitoilo-rac-glicerolu), cholesterolu i diacetylofosforanu
Walter Reed Liposomes	Liposomy z lipidem A, adsorbowane na wodorotlenku glinu
Liposomy MTP-PE	Liposomy z MTP-PE (sól monosodowa (N-acetylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1,2- -dipalmitoilo-sn-glicero-3-(hydroksy-fosforylooksy)) etyloamidu)
Proteoliposomy Sendai	Glikoproteiny wirusa Sendai (wirusa paragrypy typu 1) wbudowane w dwuwarstwę lipidów dużych, głównie monowarstwowych liposomów
Liposomy	Pęcherzykowe dwuwarstwowe struktury zbudowane z fosfolipidów i cholesterolu

 

Części składowe drobnoustrojów posiadające charakter adiuwantów i inne substancje wykorzystywane w tym celu

Adiuwant	Opis
MDP	N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutamina
GMDP	N-acetyloglukozaminylo-(ß 1 -4)-N-acetylomuramylo- -L-alanylo-D-izoglutamina (półsyntetyczny)
MTP-PE	Sól monosodowa N-acetylo-L-alanylo-D-izogluta- minylo-L-alanino-2-( 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero- -3(hydroksy-fosforylooksy))etyloamidu, związek amfifilowy
Treonylo-MDP (Termutide™)	N-acetyłomuramylo-L-treonylo-D-izoglutamina
MPL®	3-O-dezacylo-4'monofosforylo lipid A
Quil A	Saponina Quil A, saponina Quillaja
QS21	Produkt naturalny z kory Quillaja saponaria
DDA	Bromek dimetylodioktadecyloamoniowy
EQ1	Chlorek N,N-di-(Beta-stearoiloetylo)-N,N-dimetyloamoniowy

Źródło: http://docplayer.pl/15309836-Technologie-wytwarzania-szczepionek.html

 

FDA definiuje słowo bezpieczny jako względną wolność od szkodliwego wpływu na osoby związaną bezpośrednio lub pośrednio z lekiem kiedy jest roztropnie podawany biorąc pod uwagę charakter produktu w stosunku do stanu zdrowia pacjenta.

Jak sprawdzane są szczepionki pod kątem bezpieczeństwa?
Słowa Alergia i Anafilaksja zostały utworzone, aby opisać szkody po szczepionkach

…wszelkie ewentualne wątpliwości odnośnie bezpieczeństwa szczepionek bez względu na to, czy są zasadne czy nie, nie mogą ujrzeć światła dziennego z uwagi na potrzebę zapewnienia ciągłości ich wykorzystania do maksymalnego stopnia w zgodzie z celami ochrony zdrowia publicznego narodu” – stwierdzenie z 1 czerwca 1984  przez  FDA-Federal-Register(usprawiedliwiające wprowadzenie nowego prawa legalizującego niechlujstwo w czasie wytwarzania szczepionki przeciw polio

Szczepionki w USA są prawnie zaklasyfikowane do produktów, które są w sposób ‘nieunikniony niebezpieczne’ – „UNAVOIDABLY UNSAFE”, ten termin pozwala producentom uniknąć odpowiedzialności za szkody poszczepienne, sekcja B
https://www.law.cornell.edu/supct/html/09-152.ZD.html

 

Technologia wytwarzania materiału szczepionkowego w XIX wieku.

Z książki “O krzyczącej niedorzeczności i strasznej szkodliwości szczepienia ospy” Wincentego Pixa

Gdy szczepie krowy nacinano lub nakłuwano ich wymiona; to cielęta wypożyczone od rzeźnika po zbadaniu ich stanu zdrowia kładzie się na stół do góry brzuchem, przywięzuje głowę i nogi do stołu, poczem nożycami i brzytwą usuwa się sierść (kudły) z całej powierzchni od słabizny po brzuchu do łopatek, po wygolonej skórze robią się długie płytkie nacięcia i wciera w niej, materję ospową; tak pokrajane i zasmarowane zwierzątko, odwiązane i zdjęte ze stołu odprowadza się do stajni, gdzie mu dają kaganiec na pysk, i krótko uwięzują, aby się z bolu lizać po brzuchu nie mogło, i dobrze karmią; po kilku dniach cielątko bardzo choruje, bo na skórze pokaleczonej i jadowitą ropą posmarowanej potworzyły się krosteczki ospowe; następuje nowa męczarnia jego; znów je rzucają na stół do góry nogami, krępują i przywięzują do stołu, a po słabiźnie brzucha i piersiach przeciągają ostrem narzędziem i zbierają z krostek płynącą obrzydliwą ropę zmieszaną ze strupami, kudełkami, krwią i jadem trupim, a cielę ryczy w niebogłosy, bo ta okrutna operacja odbywa się w najczulszych częściach jego ciała; poczem zarzyna się cielątko i po zbadaniu przez lekarza, czy było zdrowe i nie miało w sobie jakich zarazków chorobotwórczych, odsyła się rzeźnikowi na sprzedaż do kuchnii zebraną zaś z cielęcia ropę rozciera się, miesza z gliceryną i przechowuje do szczepienia dzieci.

…przed 20 laty mówiliście, że humanizowana limfa nie przenosi weneryzmu (syfilizmu), dzisiaj zaś wobec dzieci i żołnierzy po szczepieniu chorujących na weneryzm (kiłę i syfil.) poznaliście niebezpieczeństwo i zabraniacie limfy humanizowanej, wprowadzając w jej miejsce limfę zwierzęcą (tj. cielęcą, glicerynową) jako taką, która ma nie przenosić tuberkulozy (zarazku suchot płucnych) ani weneryzmu; ale nie macie prawa tak twierdzić; tuberkuloza może się ukryć, zataić przez długie lata…

…wyrób szczepionki nienagannej czyli nieszkodliwej, bardzo jest trudnym i prawie niemożebny z powodu, że cielę, z którego zbiera się materyę szczepniczą, może mieć w sobie ukryte zarazki chorobotwórcze, lubo zdaje się być zdrowem…

… 5. Praktyka zwolenników szczepienia zmienna, guślarska i szkodliwa.

Z początku 17. i 18. wieku wcierano w ciała zdrowych ludzi ropę ospy naturalnej jako skuteczny lek przeciwko tej chorobie; od zabobonnych azyatyckich ludów i tureckich guślarzy przejęli tę metodę chciwi zysków a niepomni na swą godność lekarze europejscy; po przykrem rozczarowaniu rządy pod surową karą tej szkodliwej a niedorzecznej operacyi zakazały.
W jej miejsce dla brudnego zarobku ze szwanków na zdrowiu i życiu ludzkiem, zachwalono i wprowadzono szczepienie t. z. krowianki tj. ospy krowiej, a w jej braku nie wahano się szczepić materyą wrzodu kopyta końskiego, ospy owczej lub jakiego bądź wrzodu ludzkiego lub zwierzęcego (pisze hr. Zedwitz), gdy zaś brakło tego drogocennego elixiru, jadowitym minerałem, winnym emetykiem. Z dzieci szczepionych zbierano materyę ospową do szczepienia innych dzieci, z czego zarażały się różnemi dziecięcemi chorobami. Dla otrzymania szczepionki szczepiono krowy na wymieniu a potem cielęta na brzuchu, poddając je okrutnej torturze; z ich krostek brana materya do szczepienia ludzi przenosiła na nich choroby ludzkie i zwierzęce. Powstał wstręt powszechny i oburzenie przeciwko tej błażeńskiej i szkodliwej operacyi; przebiegli szczepnicy otumanili rządy, które operacyę kuglarską ludowi zachwalały, rozporządzeniami swemi lub państwową ustawą go do niej jako rzekomo dobroczynnego środka ochronnego znaglały, pod karą i przemocą zmuszały. Nie pomnęli na to lekarze i rządy, iż operacya taka sprzeciwia się najpierwszej zasadzie lekarskiej, aby nigdy nie szkodzić, i pierwszemu prawidłu chirurgii, aby do rany nie wprowadzać żadnej nieczystości, żadnego ciała obcego.Aby uciszyć w sobie głos sumienia i rozsądku, wmawiali przewrotni szczepiciele w siebie, w rządy i w społeczeństwo, że szczepionka jest czystą, wolną od wszelkich zarazków chorobotwórczych, i nazwali ją pięknie brzmiącą, uczoną nazwą: limfa; ależ ropa z natury swojej już jest samą nieczystością, materyą wrzodu, rozkładającą się i gnijącą, jest jadem trupim, posoką zwierzęcą; sam zdrowy rozum mówi, że co wyrzucił z siebie organizm żyjący człowieka lub zwierzęcia, jako rzecz szkodliwą i nieużyteczną, to szczepionemu do zdrowia przydatnem i nieszkodliwem być nie może, ale musi mu zawsze zaszkodzić mniej lub więcej, i nigdy na dobre nie wychodzi; bo trucizna z natury swojej zatruwa, zakaża krew i soki; przeciwnie utrzymywać, jak to czynią szczepiciele, jest nierozum i szaleństwo lub zbrodnicza szarlatanerya…